張雁儒 尚 艷 張戈宸 張 輝

(1 寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 寧波 315211； 2 鄭州市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科， 鄭州 450051；3 鄭州大學(xué)國(guó)際教育學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心， 鄭州 450001； 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科, 鄭州 450052)

周圍神經(jīng)的再生受到許多促進(jìn)以及抑制因素的作用，受損后如果想達(dá)到理想的再生，首先必須抑制神經(jīng)細(xì)胞體不可逆的變性，保持其可生長(zhǎng)的狀態(tài)，接著是誘導(dǎo)再生軸突延長(zhǎng)并穿過(guò)損傷部位，最后一步是軸突生長(zhǎng)錐貼近進(jìn)入靶器官。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)和睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)不僅能夠維持、調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞，而且能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)證明，神經(jīng)損傷能引發(fā)立早基因表達(dá), 而某些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子能阻斷這種表達(dá)。利用神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子這種較強(qiáng)的促生長(zhǎng)作用, 防止或減少周圍神經(jīng)損傷中神經(jīng)元喪失功能或死亡，促進(jìn)神經(jīng)元軸突的再生[1-6]。本研究采用同種異體脫細(xì)胞神經(jīng)支架復(fù)合BDNF和CNTF轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)纖維蛋白膠橋接術(shù)修復(fù)周圍神經(jīng)缺損，以期提高實(shí)驗(yàn)移植神經(jīng)的修復(fù)質(zhì)量，改善神經(jīng)形態(tài)學(xué)變化。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、動(dòng)物和儀器

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雜種犬20只，質(zhì)量20 kg±4 kg，雌雄不限，(鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)動(dòng)物一般狀態(tài)良好，皮毛光澤，進(jìn)食與活動(dòng)正常，分籠飼養(yǎng)，每籠飼養(yǎng)1只，自由攝食、飲水。大腸桿菌DH5α菌株由鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室保存。重組表達(dá)載體pIRES-BDNF, pIRES-CNTF和pIRES-BDNF-CNTF(鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供)。普通電子分析天平(日本SANYO公司)，脂質(zhì)體Lipofect Amine TM2000，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%胰蛋白酶溶液，胰蛋白酶、EDTA溶液， DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司。

1.2 脫細(xì)胞異體神經(jīng)支架制備

將3只健康犬，按劑量(mg/kg)給予速眠新100 mg肌肉注射麻醉，在犬右股內(nèi)側(cè)作長(zhǎng)約10 cm縱行切口，自股內(nèi)側(cè)肌間隙暴露并切斷股動(dòng)脈，放血處死動(dòng)物，向內(nèi)后方牽開股二頭肌暴露坐骨神經(jīng)，切取雙側(cè)坐骨神經(jīng)干，將切取的長(zhǎng)7～11 cm犬坐骨神經(jīng)，按照以下步驟進(jìn)行萃取處理：(1)浸浴在蒸餾水中12 h；(2)5.0% Triton X-100分解12 h；(3) 再次浸浴在蒸餾水中3 h；(4) 5.0%脫氧膽酸鈉分解消化12 h；(5) 循環(huán)上述過(guò)程；(6)重復(fù)完畢再浸入蒸餾水中3 h 。

完成犬坐骨神經(jīng)的萃取過(guò)程后，將其置于溫度4℃、pH 7.2的磷酸鹽緩沖液中，然后將犬坐骨神經(jīng)自保存液中取出進(jìn)行速凍和冷凍干燥。具體操作如下：(1)將萃取的犬坐骨神經(jīng)進(jìn)行速凍(放置在鋁板上，置于-80℃冰箱中冷凍)；(2)冷凍干燥12 h(溫度-56℃，Edwards冷凍干燥機(jī))；(3)分裝并輻照滅菌(50拉德γ射線)；(4)保存?zhèn)溆?4℃冰箱)。

經(jīng)過(guò)以上處理的犬脫細(xì)胞坐骨神經(jīng)外觀形狀良好，經(jīng)滅菌處理后備用[7-9]。

1.3 轉(zhuǎn)染BDNF和CNTF基因的BMSCs制備。

取2只實(shí)驗(yàn)犬的骨髓進(jìn)行BMSCs的分離、培養(yǎng)。取培養(yǎng)的第3代細(xì)胞，采用電轉(zhuǎn)法將重組表達(dá)載體pIRES-BDNF、pIRES-CNTF和pIRES-BDNF-CNTF轉(zhuǎn)染至BMSCs。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后分成5組，采用反轉(zhuǎn)錄半定量PCR檢測(cè)各組BMSCs的BDNF和CNTF基因的mRNA表達(dá)水平；采用免疫印跡檢測(cè)各組BMSCs的BDNF和CNTF蛋白表達(dá)水平。

1.4 制備神經(jīng)缺損動(dòng)物模型及實(shí)驗(yàn)分組

用水合氯醛麻醉15只實(shí)驗(yàn)犬，無(wú)菌條件下制備缺損8 cm坐骨神經(jīng)模型。2.5%戊巴比妥鈉按照10 mg/kg靜脈注射給藥，麻醉持續(xù)時(shí)間2～2.5 h。將麻醉后的犬俯臥位，膠帶固定嘴巴及牙齒后將其四肢分開，分別用繃帶固定于軟木板上，用8%硫化鈉脫毛處理后碘伏消毒右后肢及周圍15 cm的術(shù)野皮膚，并鋪巾備用。實(shí)驗(yàn)犬均行右后肢體后側(cè)縱行切口，牽開股二頭肌，暴露坐骨神經(jīng)，銳刀離斷坐骨神經(jīng)，并切除一段坐骨神經(jīng)，造成長(zhǎng)約8 cm的神經(jīng)缺損(圖1～4)。各組取相應(yīng)長(zhǎng)度的復(fù)合同種異體神經(jīng)，遠(yuǎn)斷端剪去2 mm，神經(jīng)斷端與移植神經(jīng)兩端長(zhǎng)度及直徑匹配對(duì)合后在顯微鏡(10倍)下用8/0無(wú)損傷縫合線行外膜吻合。肌肉覆蓋保護(hù)坐骨神經(jīng)，徹底止血后，用1號(hào)絲線縫合關(guān)閉傷口，創(chuàng)面2層紗布覆蓋，繃帶固定。將制成的坐骨神經(jīng)缺損模型隨機(jī)分為CEANA+BDNF組、CEANA+CNTF組、CEANA+BDNF+CNTF組、CEANA組(采用8 cm CEANA端端吻合缺損的坐骨神經(jīng))、CEANA+BMSCs組。

1.5 觀測(cè)指標(biāo)

1.5.1 一般情況 術(shù)后犬分籠飼養(yǎng)，手術(shù)后8周內(nèi)要詳細(xì)觀察并記錄手術(shù)后犬的精神狀態(tài)、肢體活動(dòng)、傷口情況和患肢運(yùn)動(dòng)功能。術(shù)后16周內(nèi)詳細(xì)觀察并記錄犬患足部潰瘍形成及愈合情況、患肢體功能的恢復(fù)情況及并發(fā)癥的發(fā)生情況。

1.5.2 肌電圖檢測(cè) 術(shù)后16周時(shí)用2%戊巴比妥鈉按40 mg/kg劑量進(jìn)行腹腔麻醉，暴露并游離右側(cè)移植段坐骨神經(jīng)及對(duì)側(cè)正常坐骨神經(jīng)，將刺激電極置于近端神經(jīng)吻合口處，記錄電極刺入比目魚肌，記錄犬坐骨神經(jīng)移植修復(fù)術(shù)后的神經(jīng)電生理及比目魚肌動(dòng)作電位等情況。檢測(cè)指標(biāo)包括：比目魚肌的動(dòng)作電位、雙側(cè)坐骨神經(jīng)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度、雙側(cè)坐骨神經(jīng)的感覺(jué)神經(jīng)傳導(dǎo)速度。

1.5.3 H-E染色 術(shù)后16周取各實(shí)驗(yàn)組坐骨神經(jīng)移植段，取材分別包含神經(jīng)近端吻合口以及近遠(yuǎn)端吻合口以遠(yuǎn)1 cm，取材后用10%福爾馬林常規(guī)固定并用石蠟包埋，切片需包含神經(jīng)吻合口遠(yuǎn)近端2 mm的范圍，采用連續(xù)切片法，吻合口處行縱切片，其他部位行橫切片。常規(guī)H-E染色、髓鞘染色，移植段神經(jīng)橫斷切片染色后，計(jì)數(shù)神經(jīng)束內(nèi)軸突，并測(cè)量神經(jīng)束面積，計(jì)算軸突密度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的BDNF和CNTF的mRNA表達(dá)

以含有BDNF基因全長(zhǎng)cDNA的質(zhì)粒pCMV-SPORT6-BDNF為模板，使用BDNF基因擴(kuò)增引物BDNF-Upper Primer 5′ CCTCGAGATGTTCCACCA-GGTGAGAAGAGTGA 3′和BDNF-Lower Primer 5′CACGCGTCTATCTTCCCCTTTTAATGGTCAGT 3′，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物電泳可見788 bp的BDNF目的基因條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。

以含有CNTF基因全長(zhǎng)cDNA的質(zhì)粒pCMV-SPORT6-CNTF為模板，使用CNTF基因擴(kuò)增引物CNTF-Upper Primer 5′ GTCTAGAATGTTCCACCA-GGTGAGAAGAGTGA 3′和CNTF-Lower Primer 5′GGTCGACCTATCTTCCCCTTTTAATGGTCAGT 3′，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物電泳可見611 bp的CNTF目的基因條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。

2.2 重組載體pIRES-BDNF、pIRES-CNTF的鑒定

2.2.1 PCR鑒定 BDNF與pIRES、CNTF與pIRES連接后轉(zhuǎn)化在氨芐青霉素LB平板，均長(zhǎng)出多個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌。各隨機(jī)挑取2個(gè)，分別使用BDNF、CNTF基因擴(kuò)增引物BDNF-Upper Primer 5′ CCTCGAGATGT-TCCACCAGGTGAGAAGAGTGA 3′和BDNF-Lower Primer 5′CACGCGTCTATCTTCCCCTTTTAATG-GTCAGT 3′、 CNTF-Upper Primer 5′ GTCTAGAA-TGTTCCACCAGGTGAGAAGAGTGA 3′和CNTF-Lower Primer 5′GGTCGACCTATCTTCCCCTTTT-AATGGTCAGT 3′擴(kuò)增，產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴(kuò)增結(jié)果, 分別判定目的基因BDNF、CNTF基因是否插入， 結(jié)果都得到788 bp的BDNF目的基因條帶、611 bp的CNTF目的基因條帶，初步證實(shí)得到重組載體pIRES-BDNF、pIRES-CNTF。

2.2.2 酶切鑒定 對(duì)PCR鑒定初步篩選為陽(yáng)性重組子pIRES-BDNF 、pIRES-CNTF分別提取質(zhì)粒，分別雙酶切再次鑒定。XhoI和MluI雙酶切重組質(zhì)粒pIRES-BDNF，可以得到2個(gè)片段，即774 bp目的基因BDNF片段和約6.1 kb的pIRES載體片段，再次證實(shí)獲得的pIRES-BDNF正確；XbaI和SalI雙酶切重組質(zhì)粒pIRES-CNTF，可以得到2個(gè)片段，即597 bp目的基因CNTF片段和約6.1 kb的pIRES載體片段，再次證實(shí)獲得的pIRES-CNTF正確。

2.2.3 DNA序列測(cè)定及分析 對(duì)PCR擴(kuò)增和XhoI 、MluI雙酶切鑒定正確的pIRES-BDNF的MCS-A插入序列雙向測(cè)序后，與GenBank中NM_007540BDNF基因序列進(jìn)行同源性比較分析，結(jié)果與設(shè)計(jì)完全一致。說(shuō)明得到正確的重組載體pIRES-BDNF。

對(duì)PCR擴(kuò)增和XbaI和SalI雙酶切鑒定正確的pIRES-CNTF的MCS-B插入序列雙向測(cè)序后，與GenBank中NM_170786CNTF基因序列進(jìn)行同源性比較分析，結(jié)果與設(shè)計(jì)完全一致，說(shuō)明得到正確的重組載體pIRES-CNTF。

2.4 重組雙基因表達(dá)載體pIRES-BDNF-CNTF的構(gòu)建

2.4.1 雙基因重組子的PCR鑒定 CNTF與pIRES-BDNF連接后轉(zhuǎn)化在氨芐青霉素LB平板長(zhǎng)出大量的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌，隨機(jī)挑取2個(gè)菌落，分別劃線保種，并接種含氨芐青霉素液體LB震蕩培養(yǎng)，分別提取質(zhì)粒。使用CNTF基因擴(kuò)增引物CNTF-Upper Primer 5′ GTCTAGAATGTTCCACCAGGTGAGAAGAGTGA 3′和CNTF-Lower Primer 5′GGTCGACCTATCTTC-CCCTTTTAATGGTCAGT 3′ 擴(kuò)增1∶100稀釋的提取質(zhì)粒電泳分析PCR擴(kuò)增結(jié)果，可見有611 bp目的基因CNTF, 說(shuō)明目的基因CNTF插入載體pIRES-BDNF的MCS-B。同時(shí)使用BDNF基因擴(kuò)增引物BDNF-Upper Primer 5′ CCTCGAGATGTTCCACCA-GGTGAGAAGAGTGA 3′和BDNF-Lower Primer 5′CACGCGTCTATCTTCCCCTTTTAATGGTCAGT 3′，擴(kuò)增，亦可見788 bp目的基因BDNF基因還在載體pIRES上。初步證實(shí)得到重組雙基因表達(dá)載體pIRES-BDNF-CNTF。

2.4.2 雙基因重組子的酶切鑒定 在PCR擴(kuò)增鑒定的基礎(chǔ)上，再用XbaI和SalI以及XhoI和MluI同時(shí)酶切再次鑒定重組子質(zhì)粒DNA，酶切產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，可見6.1 kb的載體條帶、774 bp BDNF基因條帶和597 bp CNTF基因條帶。證實(shí)得到重組雙基因表達(dá)載體pIRES-BDNF-CNTF。

2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

BDNF組(轉(zhuǎn)染重組表達(dá)載體pIRES-BDNF)、CNTF組(轉(zhuǎn)染重組表達(dá)載體pIRES-CNTF)、BDNF-CNTF組(轉(zhuǎn)染重組雙基因表達(dá)載體pIRES-BDNF-CNTF)、載體對(duì)照組(轉(zhuǎn)染空載體pIRES)的細(xì)胞電轉(zhuǎn)24 h后，更換含有 400 μg/ml G418的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng)，大約3周，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BMSCs(圖1)，遂改用含有200 μg/ml G418的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行維持培養(yǎng)。

2.6 RT-PCR檢測(cè)

BDNF組、CNTF組、BDNF-CNTF組、載體對(duì)照組和BMSCs對(duì)照組的細(xì)胞BDNF mRNA相對(duì)表達(dá)量數(shù)值見表1?？瞻讓?duì)照組與載體對(duì)照組細(xì)胞的BDNF mRNA相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；BDNF組、BDNF-CNTF組細(xì)胞的BDNF mRNA相對(duì)表達(dá)量與BMSCs對(duì)照組的BDNF mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明轉(zhuǎn)染重組表達(dá)載體pIRES-BDNF的單基因BDNF表達(dá)組細(xì)胞和轉(zhuǎn)染重組雙基因表達(dá)載體pIRES-BDNF-CNTF雙基因BDNF-CNTF表達(dá)組細(xì)胞中的pIRES-BDNF和pIRES-BDNF-CNTF均可高效轉(zhuǎn)錄BDNF mRNA。BDNF組、CNTF組、BDNF-CNTF組、載體對(duì)照組和MSCs對(duì)照組的細(xì)胞CNTF mRNA相對(duì)表達(dá)量數(shù)值(表1)顯示?？瞻讓?duì)照組與載體對(duì)照組細(xì)胞的CNTF mRNA相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CNTF組、BDNF-CNTF組細(xì)胞的CNTF mRNA相對(duì)表達(dá)量與BMSCs對(duì)照組的CNTF mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明轉(zhuǎn)染重組表達(dá)載體pIRES-CNTF的CNTF組細(xì)胞和轉(zhuǎn)染重組雙基因表達(dá)載體pIRES-BDNF-CNTF雙基因BDNF-CNTF組細(xì)胞中的pIRES-CNTF和pIRES-BDNF-CNTF均可高效轉(zhuǎn)錄CNTF mRNA。

圖1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的各組BMSCsFig 1 BMSCs of stable transfection in the each group

表1 各組細(xì)胞BDNF和CNTF mRNA相對(duì)表達(dá)量Tab 1 Relative expression of BDNF and CNTF mRNA in groups

2.7 免疫印跡檢測(cè)

BDNF組和BDNF-CNTF組BMSCs BDNF蛋白表達(dá)很強(qiáng)，而CNTF組、載體對(duì)照組和BMSCs對(duì)照組細(xì)胞BDNF表達(dá)弱(圖2)。轉(zhuǎn)染說(shuō)明轉(zhuǎn)染重組載體pIRES-BDNF和pIRES-BDNF-CNTF的BDNF組和BDNF-CNTF組BMSCs中pIRES-BDNF和pIRES-BDNF-CNTF均可高效表達(dá)BDNF蛋白。

CNTF組和BDNF-CNTF組BMSCs CNTF蛋白表達(dá)很強(qiáng)，而BDNF組、載體對(duì)照組和BMSCs對(duì)照組細(xì)胞CNTF蛋白表達(dá)弱(圖2)。轉(zhuǎn)染說(shuō)明轉(zhuǎn)染重組載體pIRES-CNTF和pIRES-BDNF-CNTF的CNTF組和BDNF-CNTF組BMSCs中pIRES-CNTF和pIRES-BDNF-CNTF均可高效表達(dá)CNTF蛋白。

由此證實(shí)，得到高效單基因BDNF表達(dá)BMSCs細(xì)胞株、高效單基因CNTF表達(dá)BMSCs細(xì)胞株和高效雙基因BDNF-CNTF表達(dá)BMSCs細(xì)胞株。

圖2 免疫印跡Fig 2 Western blotting

2.8 動(dòng)物一般情況

各組實(shí)驗(yàn)犬在術(shù)后2～7周均漸出現(xiàn)手術(shù)側(cè)足部紅腫、潰瘍的發(fā)生及跛行，小腿三頭肌的力量較差，行走時(shí)踝關(guān)節(jié)不能完全直立。7周后運(yùn)動(dòng)功能均有不同程度的恢復(fù)；CEANA+BDNF+CNTF組的足部潰瘍明顯較其他組愈合快，16周后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)明顯好于其他組。而CEANA組、CEANA+BMSCs組神經(jīng)再生修復(fù)效果不佳，足部及小腿長(zhǎng)期紅腫、潰瘍不愈合。

2.9 移植段神經(jīng)大體觀察

在實(shí)驗(yàn)犬術(shù)后16周時(shí)，用2% 戊巴比妥鈉按劑量40 mg/kg進(jìn)行腹腔麻醉，暴露移植側(cè)坐骨神經(jīng)，可見CEANA組和CEANA+BMSCs組移植段神經(jīng)連續(xù)性好與周圍組織黏連嚴(yán)重，周圍局部組織增生形成疤痕，吻合口可觸及硬結(jié)，神經(jīng)表面血管化程度差，移植段遠(yuǎn)近端坐骨神經(jīng)干變細(xì)變硬(圖3)。而CEANA+BDNF組、CEANA+CNTF組、CEANA+BDNF+CNTF組移植段神經(jīng)連續(xù)性好，無(wú)移植段神經(jīng)的脫落及分離與周圍組織沒(méi)有硬化性瘢痕黏連，CEANA+BDNF+CNTF組和CEANA+BDNF組相比較移植段神經(jīng)周圍炎性反應(yīng)不明顯，神經(jīng)表面有明顯毛細(xì)血管網(wǎng)，兩吻合口略膨大，橋接移植段遠(yuǎn)近端神經(jīng)干外觀基本正常(圖4)。

2.10 軸突計(jì)數(shù)

軸突密度是單位神經(jīng)束面積內(nèi)的軸突數(shù)目，反映了神經(jīng)纖維再生情況。CEANA+BDNF+CNTF組軸突密度與CEANA+BDNF組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。提示CEANA+BDNF+CNTF組橋接移植修復(fù)犬坐骨神經(jīng)缺損后更有利于軸突再生、神經(jīng)纖維的通過(guò)及神經(jīng)功能的恢復(fù)。

2.11 肌電圖測(cè)量及分析

術(shù)后16周，CEANA+BDNF+CNTF組實(shí)驗(yàn)犬的比目魚肌誘發(fā)電位波幅明顯高于CEANA+BDNF組；之后，2組運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位的潛伏期逐漸縮短，波幅逐漸增高；CEANA+BDNF+CNTF組與CEANA+BDNF組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖4 術(shù)后16周CEANA+BDNF+CNTF組移植段神經(jīng)，圖中箭頭示吻合口Fig 4 16 weeks after operation, CEANA+BDNF+CNTF group was transplanted with nerve, and the arrow showed anastomosis

術(shù)后16周，CEANA+BDNF組和CEANA+CNTF組患側(cè)坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度無(wú)差異，與正常肢體坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

表2 術(shù)后16周肌電圖及神經(jīng)傳導(dǎo)速度比較Tab 2 Electromyography and nerve conduction velocity at 16 weeks after

3 討論

在周圍神經(jīng)的再生過(guò)程中，微環(huán)境有著非常重要的作用，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素在其中發(fā)揮了主要作用。大量的實(shí)驗(yàn)研究顯示，這些可溶性的蛋白因子能夠促進(jìn)某些神經(jīng)再生相關(guān)酶的合成，并且通過(guò)抑制神經(jīng)元的凋亡，從而對(duì)神經(jīng)元的再生、塑形和存活發(fā)揮作用。BDNF和CNTF是重要的神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子, 它能作用于中樞神經(jīng)元和周圍神經(jīng)元, 不僅能夠提高雞胚感覺(jué)神經(jīng)元體外培養(yǎng)的存活率，而且促進(jìn)突起的生長(zhǎng)[10-16]。

BMSCs是一類非造血的成體干細(xì)胞，具有多項(xiàng)分化的能力，能分化成各種細(xì)胞，大量的實(shí)驗(yàn)證明間充質(zhì)干細(xì)胞能分化為神經(jīng)元，而且能在體外培養(yǎng)分化表達(dá)施萬(wàn)細(xì)胞標(biāo)記物，對(duì)周圍神經(jīng)缺損后的再生也有促進(jìn)作用。大量的細(xì)胞免疫學(xué)研究表明MSCs具有很低的免疫原性，它只表達(dá)主要組織相容性抗原MHCⅠ類分子，不表達(dá)MHCⅡ類分子。綜上BMSCs有以下優(yōu)點(diǎn)：來(lái)源充足，增殖能力強(qiáng)，免疫抗原性低[17-20]。

本實(shí)驗(yàn)顯示，使用脫細(xì)胞同種異體神經(jīng)移植修復(fù)手術(shù)后，手術(shù)部位的組織黏連較輕，沒(méi)有明顯的炎癥反應(yīng)，只有很少的瘢痕組織形成，軸突密度很大，神經(jīng)再生速度和效果都很好，而且比目魚肌的誘發(fā)電位波幅高?；瘜W(xué)萃取以后的異體神經(jīng)抗原性極低，減少了手術(shù)后的免疫排斥反應(yīng)，為神經(jīng)再生形成理想的微環(huán)境，能夠引導(dǎo)再生的周圍神經(jīng)軸突從斷離神經(jīng)的近端趨向遠(yuǎn)端生長(zhǎng)，減少神經(jīng)迷行再生，提高神經(jīng)通過(guò)率，保證再生神經(jīng)的高選擇性支配，更有利于再生神經(jīng)的生長(zhǎng)和功能的恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染的重組載體pIRES-BDNF和pIRES-BDNF-CNTF在神經(jīng)移植體中正常表達(dá)； 其中BDNF+CNTF/BMSCs復(fù)合CEANA組和CNTF/BMSCs復(fù)合CEANA組的神經(jīng)移植體CNTF表達(dá)很強(qiáng)，顯示轉(zhuǎn)染的重組載體pIRES-CNTF和pIRES-BDNF-CNTF在神經(jīng)移植體中均正常表達(dá)。說(shuō)明把腦源性和睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子注入移植體附近滲透入同種異體脫細(xì)胞神經(jīng)所形成的再生室內(nèi)后，這些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子就可以對(duì)周圍神經(jīng)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元起作用，促進(jìn)神經(jīng)的再生。實(shí)驗(yàn)顯示聯(lián)合應(yīng)用兩種神經(jīng)因子效果顯著優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用其中一種，由此可以推測(cè)CNTF+BDNF的共同使用具有協(xié)同作用，其具體機(jī)制仍需要更深入的研究。