楊玥欣 沈夏波 武雅靜 桂 麗 賈雪梅
(安徽醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,安徽 合肥 230032)
研究發(fā)現(xiàn)高脂血癥患者伴隨有口渴的癥狀,這可能與下頜下腺的唾液分泌功能異常有關(guān)〔1〕。水通道蛋白(AQPs)是一類具有轉(zhuǎn)運(yùn)水和其他小分子可溶物的蛋白質(zhì)家族,在唾液分泌過程中起重要作用。AQP2是唯一一種功能受控的AQP5,AQP5可能是AQP2表達(dá)的校準(zhǔn)器〔2〕。高脂血癥大鼠下頜下腺中AQP5的表達(dá)存在異?!?〕,但AQP2 的表達(dá)是否隨之改變還未闡明。AQP4可在細(xì)胞間快速轉(zhuǎn)運(yùn)水,且該作用受AQP4四聚體結(jié)構(gòu)的阻礙〔3〕。AQP4在高脂血癥患者下頜下腺的表達(dá)變化也不清楚。本實(shí)驗(yàn)觀察高脂血癥組大鼠下頜下腺AQP2和AQP4的表達(dá)變化。
1.1試劑AQP2和AQP4的抗體(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)、SP 免疫組織化學(xué)試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。
1.2高脂血癥動(dòng)物模型復(fù)制雄性SD大鼠20只,體質(zhì)量110~160 g,安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,普通級(jí),隨機(jī)分為兩組,每組10只。對(duì)照組予以全價(jià)飼料喂養(yǎng);高脂血癥組給予高脂飲食(膽固醇 2%、 豬油10%、 基礎(chǔ)飼料 88%),復(fù)制高脂血癥模型;連續(xù)觀察2個(gè)月,各組動(dòng)物均不限制飲食和飲水。
1.3標(biāo)本制備用20%烏拉坦1 ml/100 g,腹腔注射,麻醉后剖開腹腔,下腔靜脈取血,行三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)檢測;取下頜下腺固定于10%甲醛溶液,常規(guī)石蠟包埋,切片4 μm。
1.4蘇木素-伊紅(HE)染色切片脫蠟至水,入蘇木精染色15 min,再進(jìn)行鹽酸乙醇分色、藍(lán)化、伊紅染色、脫水、透明和封片,顯微鏡下觀察下頜下腺病理學(xué)改變。
1.5免疫組化染色石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,檸檬酸鹽緩沖液修復(fù),微波爐高火8 min,靜置3 min,再高火4 min,冷卻至室溫。3%H2O2,37℃孵育20 min;滴加AQP2一抗溶液(1∶200)和AQP4一抗溶液(1∶100),滴加50 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照,4℃過夜,切片從冰箱取出恢復(fù)至室溫;滴加二抗(生物素標(biāo)記的山羊抗兔的IgG),37℃孵育30 min;辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液,37℃孵育30 min。以上步驟之間都以PBS沖洗3次×3 min。滴加DAB顯色3 min。自來水沖洗;蘇木精復(fù)染,放入自來水中藍(lán)化,脫水,透明和封片。在10×40倍光鏡下,利用Nikon彩色數(shù)碼CCD攝像頭捕獲各組切片中AQP2和AQP4的圖像,每張切片隨機(jī)選取6個(gè)視野,再用捷達(dá)生物圖像軟件計(jì)算各組AQP2和AQP4免疫陽性細(xì)胞的平均光密度值(MOD)。
1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。
2.1兩組血脂水平比較對(duì)照組TG〔(0.784 8±0.212 7)mmol/L〕、TC〔(1.250 6±0.353 9)mmol/L〕水平明顯低于高脂血癥組〔(2.761 8±0.526 0)mmol/L、(5.822 3±0.981 9)mmol/L,P<0.05〕。
2.2兩組下頜下腺病理學(xué)觀察對(duì)照組大鼠腺泡飽滿,結(jié)構(gòu)清晰。高脂血癥組大鼠腺泡萎縮,直徑變小,可見結(jié)締組織增生,見圖1。
2.3兩組下頜下腺AQP2免疫組化表達(dá)對(duì)照組和高脂血癥組大鼠下頜下腺AQP2都呈陽性,大多呈棕褐色。在黏液性腺泡區(qū),AQP2免疫陽性反應(yīng)物主要沉積于紋狀管導(dǎo)管上皮胞質(zhì)內(nèi);在漿液性腺泡區(qū),AQP2主要在紋狀管表達(dá),腺泡中也有表達(dá),而顆粒曲管中則無表達(dá),見圖2。對(duì)照組(0.926 1±0.066 2)和高脂血癥組下頜下腺AQP2表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.981 9±0.177 9,P>0.05)。
2.4兩組下頜下腺AQP4免疫組化表達(dá)在黏液性腺泡區(qū),對(duì)照組、高脂血癥組下頜下腺AQP4免疫陽性反應(yīng)物主要沉積在紋狀管導(dǎo)管上皮細(xì)胞,呈棕褐色;在漿液性腺泡區(qū),AQP4主要表達(dá)在紋狀管,腺泡中也有表達(dá),但顆粒曲管中無表達(dá),見圖3。與對(duì)照組(1.098 6±0.083 4)相比,高脂血癥組AQP4免疫陽性反應(yīng)物表達(dá)明顯減弱(1.009 8±0.086 6,t=2.374,P<0.05),呈淺棕黃色。
圖1 兩組下頜下腺黏液性、漿液性腺泡區(qū)組織結(jié)構(gòu)(HE,×400)
圖2 兩組下頜下腺黏液性、漿液性腺泡區(qū)AQP2表達(dá)(DAB,×400)
圖3 兩組下頜下腺黏液性、漿液性腺泡區(qū)AQP4表達(dá)(DAB,×400)
AQP2主要表達(dá)在腎臟結(jié)合小管和集合管的主細(xì)胞,與糖尿病腎病關(guān)系密切〔2,4,5〕。本文結(jié)果顯示,與正常大鼠比較,高脂血癥大鼠下頜下腺AQP2的表達(dá)無明顯變化。AQP2的量和細(xì)胞定位受到多種激素和信號(hào)分子的影響,包括精氨酸加壓素(AVP)。高鈉血癥或低血容量時(shí),AVP從垂體后葉分泌到血流中〔6〕,它促成細(xì)胞內(nèi)從小囊泡到頂膜的AQP2水通道蛋白的重新分配〔7〕,增強(qiáng)水的重吸收及其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)〔5〕。AVP受體主要存在于全身血管平滑肌、腎臟遠(yuǎn)端后端和集合管上皮細(xì)胞以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)〔8〕,而目前尚未有AVP受體在大鼠下頜下腺中表達(dá)的報(bào)道。據(jù)此推測,AVP受體在大鼠下頜下腺中表達(dá)含量過低或不表達(dá)可能導(dǎo)致高脂血癥大鼠AQP2的表達(dá)不受影響。AQP4廣泛分布于體內(nèi),包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腎、肺、結(jié)腸,也可在支氣管上皮表達(dá)〔9〕。有實(shí)驗(yàn)證明AQP4在干燥綜合征大鼠下頜下腺表達(dá)〔10〕,AQP4是維持下頜下腺水平衡的重要水通道蛋白,在唾液形成的過程中有重要的作用。本文顯示與正常大鼠比較,高脂血癥大鼠下頜下腺AQP4的表達(dá)明顯下降,據(jù)此推測,AQP4表達(dá)減少會(huì)導(dǎo)致下頜下腺導(dǎo)管對(duì)水的轉(zhuǎn)運(yùn)功能下降,引起唾液的分泌量減少,這可能是導(dǎo)致高脂血癥患者口渴的原因之一。AQP4表達(dá)減少的原因可能有:①缺血缺氧使AQP4的表達(dá)發(fā)生改變。據(jù)報(bào)道,缺氧/缺血 24 h后,大腦組織中血管和突觸周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞足突上的AQP4 表達(dá)下降,使星形膠質(zhì)細(xì)胞死亡〔11〕。而高脂血癥的直接損害是加速全身動(dòng)脈粥樣硬化,一旦動(dòng)脈被粥樣斑塊堵塞,就會(huì)導(dǎo)致局部組織如下頜下腺缺氧缺血,引起AQP4 表達(dá)下降。②高脂血癥時(shí)游離的脂肪酸和TG的升高導(dǎo)致胰島素抵抗,下頜下腺組織出現(xiàn)葡萄糖代謝障礙,導(dǎo)致AQP4合成能量不足,AQP4表達(dá)下降。③蛋白激酶C和MAPKs信號(hào)通路參與AQP4的表達(dá)調(diào)節(jié)〔12〕,有研究表明在高脂血癥大鼠的胰腺中蛋白激酶C活化,據(jù)此推測,蛋白激酶C激活可以抑制下頜下腺中的AQP4基因的表達(dá),減少mRNA的產(chǎn)生〔13〕。而高脂血癥大鼠血液中的TG和TC的慢性刺激可誘導(dǎo)蛋白激酶C的活化,使下頜下腺AQP4表達(dá)減少。④根據(jù)翻譯起始處蛋氨酸M1和M23的不同,將AQP4分為兩個(gè)亞型,內(nèi)源性AQP4是同時(shí)含有M1(含 323 個(gè)氨基酸 )和M23(含有 301 個(gè)氨基酸)的四聚體,它們共同組成四聚體存在于細(xì)胞膜上〔14〕。高脂血癥大鼠下頜下腺中也可能由于AQP4亞型結(jié)合的比例失調(diào),導(dǎo)致表達(dá)的下降,使其轉(zhuǎn)運(yùn)水的功能發(fā)生改變。
1崔芳芹,賈雪梅,汪淵,等.高脂血癥大鼠下頜下腺內(nèi)AQP1和AQP5表達(dá)及意義〔J〕.中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志,2012;21(1):74-8.
2Wu H,Chen L,Zhang X,etal.Aqp5 is a new transcriptional target of Dot1a and a regulator of Aqp2〔J〕.PLoS One,2013;8(1):1-12.
3Tani K,F(xiàn)ujiyoshi Y.Water channel structures analysed by electron crystallography〔J〕.Biochim Biophys Acta,2014;1840(5):1605-13.
4Sales AD,Lobo CH,Carvalho AA,etal.Structure,function,and localization of aquaporins:their possible implications on gamete cryopreservation〔J〕.Genet Mol Res,2013;12(4):6718-32.
5Kortenoeven ML,F(xiàn)enton RA.Renal aquaporins and water balance disorders〔J〕.Biochim Biophys Acta,2014;1840(5):1533-49.
6Voisin DL,Bourque CW.Integration of sodium and osmosensory signals in vasopressin neurons〔J〕.Trends Neurosci,2002;25(4):199-205.
7Katsura T,Gustafson CE,Ausiello DA,etal.Protein kinase A phosphorylation is involved in regulated exocytosis of aquaporin-2 in transfected LLC-PK1 cells〔J〕.Am J Physiol,1997;272(6 Pt 2):F817-22.
8王鑫,陳長選.精氨酸血管升壓素與夜間多尿關(guān)系的研究進(jìn)展〔J〕.中國實(shí)用醫(yī)刊,2013;40(7):107-8.
9丁建中,賀尚榮,張燕翔,等.水通道蛋白4在外燥小鼠肺組織表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.長江大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2010;7(3):1-2;28.
10Nakamura M,Saga T,Watanabe K,etal.An immunohistochemistry-based study on aquaporin (AQP)-1,3,4,5 and 8 in the parotid glands,submandibular glands and sublingual glands of Sj?gren′s syndrome mouse models chronically administered cevimeline〔J〕.Kurume Med J,2013;60(1):7-19.
11黃鶴鳴,褚曉凡.AQP4與星形膠質(zhì)細(xì)胞脹亡之間的關(guān)系〔J〕.中國當(dāng)代醫(yī)藥,2013;20(10):21-3,29.
12宋富強(qiáng),郭文瓊,呼永河.AQP4在促進(jìn)腦水腫形成和消退中的雙重角色〔J〕.西南軍醫(yī),2013;15(5):497-500.
13王亞軍,孫家邦,李非,等.高脂血癥對(duì)急性胰腺炎的影響〔J〕.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2008;24(18):3108-10.
14劉俊秀,賴蓉,鐘德霞.表達(dá)AQP4不同亞型的細(xì)胞系檢測AQP4抗體敏感性的研究〔J〕.中山大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)科學(xué)版),2012;33(5):587-91.