胡澤楠　任　茜　嚴(yán)　俊　周永寧

(蘭州大學(xué)第一醫(yī)院消化科，甘肅　蘭州　730000)

肝癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤，目前尚缺乏行之有效的方法輔助手術(shù)切除的肝癌患者自我修復(fù)〔1〕。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)由于來(lái)源豐富，具有多方向分化的潛能，而展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景〔2〕。BMSCs歸巢的特性，也為輸注輔助治療肝癌提供了新策略〔3,4〕。本研究采用腺病毒轉(zhuǎn)染標(biāo)記綠色熒光的BMSCs輸注，觀察輸注BMSCs對(duì)肝癌是否有保護(hù)作用。

1　材料與方法

1.1材料健康雄性SD幼鼠，實(shí)驗(yàn)操作符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。主要儀器及試劑：酶標(biāo)儀(TECAN sunrise)、低溫超高速離心機(jī)(Thermo)、熒光顯微鏡(Zeiss)、恒冷箱切片機(jī)(Shandon)、低糖DMEM培養(yǎng)液(hyclone)、胎牛血清(FBS，Sigma)、青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml。

1.2方法

1.2.1BMSCs的體外分離、培養(yǎng)將成年雄性SD大鼠泡在碘酒中消毒處死,剝離皮膚和肌肉，取出兩側(cè)股骨，剪斷兩端。用L-DMEM 培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔,收集沖洗液,接種到涂有多聚賴氨酸的50 ml 培養(yǎng)瓶中,并置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以后每隔2 d進(jìn)行換液。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶時(shí),進(jìn)行傳代培養(yǎng)。用D-Hank液清洗細(xì)胞表面,0.25% 胰酶(0.02%EDTA) 消化1 min后，用含血清的培養(yǎng)液終止消化。等到90%的細(xì)胞從貼壁狀態(tài)轉(zhuǎn)化為懸浮狀態(tài)，吹打細(xì)胞，并收集細(xì)胞懸液,1 000 r/min離心5 min后,用含10%FBS的培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞。將細(xì)胞接種至兩個(gè)培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞再長(zhǎng)滿瓶底時(shí),同樣按照上述方法進(jìn)行傳代。

1.2.2BMSCs的標(biāo)記鑒定獲取P3～P5代BMSCs，去除培養(yǎng)液后，用D-Hank漂洗1次，用0.25%胰酶(0.02% EDTA) 消化至細(xì)胞懸浮后，再用含血清的培養(yǎng)液終止消化。離心5 min收集細(xì)胞。用含血清的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞后，用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。計(jì)算體積0.5 ml、含3×106mmol/L BMSCs，獲取相應(yīng)細(xì)胞量再離心，后棄上清液。以相應(yīng)體積的D-Hank培養(yǎng)液重新懸浮BMSCs。將構(gòu)建好的表達(dá)綠色熒光蛋白的腺病毒(Adv-GFP)按MOI200轉(zhuǎn)染細(xì)胞。第2天將標(biāo)記上GFP的MSCs按3×106mmol/L 0.5 ml尾靜脈注射到大鼠體內(nèi)。標(biāo)記上綠色熒光的BMSCs在熒光顯微鏡下拍照鑒定。

1.2.3SD鼠肝癌模型構(gòu)建和BMSCs輸注及其觀察用含0.02 ppm黃曲霉毒素(AF)B1的飼料喂食大鼠120 d，構(gòu)建肝癌模型。將建模成功的肝癌大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和治療組。對(duì)照組接受0.5 ml D-Hank輸注。治療組接受含3×106mmol/L，0.5 ml BMSCs的D-Hank輸注。

1.2.4BMSCs輸注2 w后觀察治療效果移植2 w后，檢測(cè)兩組中輸注細(xì)胞的歸巢情況。SD大鼠用1%的戊巴比妥鈉麻醉后備皮，切開(kāi)皮膚，在脊柱旁開(kāi)1 cm處椎旁肌內(nèi)植入2 mm PLGA支架，去細(xì)胞脊髓支架和三維明膠海綿支架。兩組大鼠縫線縫合肌肉及皮膚,術(shù)后分組飼養(yǎng),每日2次肌注抗菌素。每天觀察皮膚手術(shù)切口及動(dòng)物反應(yīng)變化。于手術(shù)后第1周將大鼠灌注，固定：將1%戊巴比妥鈉注射到大鼠腹腔內(nèi)致死； 剪開(kāi)胸腔，充分暴露心臟。將灌注針從心室插管至升主動(dòng)脈，并用鉗子固定針管。同時(shí)快速灌注磷酸鹽緩沖液(PBS)120 ml以沖去血液，開(kāi)始灌注時(shí)剪開(kāi)心耳放血,以形成灌注流，沖洗至肝臟無(wú)血色即為沖洗血液干凈。先快速灌注50 ml 4%的多聚甲醛，后慢速灌注250 ml，固定時(shí)間控制在至少30 min。取肝臟組織，冰凍切片，片厚30 μm，取組織進(jìn)行Hoechst33342染色，熒光鏡下計(jì)數(shù)組織中綠色熒光細(xì)胞數(shù)目。每組5只動(dòng)物，每只動(dòng)物選8張切片進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.5RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1、程序化凋亡因子PDCD4基因的表達(dá)引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。使用Trizol法裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行純度鑒定,將RNA 用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后經(jīng)PCR擴(kuò)增出相應(yīng)cDNA。PCR產(chǎn)物最后通過(guò)電泳進(jìn)行半定量。

表1　TGF-β1、PDCD4基因的引物

1.2.6Western印跡檢測(cè)c-fos蛋白的表達(dá)用10%分離膠分離蛋白，然后濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，室溫下封閉，使用總抗c-fos(abcam,ab48942)一抗孵育過(guò)夜，第2天用羊抗兔

辣根過(guò)氧化物酶(HRP)孵育1 h后，加入顯色劑，曝光。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0軟件行方差分析。

2　結(jié)　果

2.1大鼠BMSCs的標(biāo)記見(jiàn)圖1，第4代細(xì)胞中BMSCs形態(tài)比較均一，多為長(zhǎng)梭形或紡錘狀。將標(biāo)記有GFP的腺病毒轉(zhuǎn)染之后，骨髓干細(xì)胞在熒光顯微鏡下顯示綠色熒光，細(xì)胞形態(tài)為長(zhǎng)梭形、成纖維細(xì)胞樣或多角形，呈放射狀，形成小集落，胞界清楚。經(jīng)過(guò)細(xì)胞核Hoechst33342染色，可以觀察到轉(zhuǎn)染病毒后的細(xì)胞狀態(tài)良好，可用于體內(nèi)示蹤標(biāo)記。

2.2大鼠肝臟中綠色BMSCs的數(shù)量見(jiàn)圖2。對(duì)照組肝臟中無(wú)含綠色熒光標(biāo)記的BMSCs，而治療組中可以看到切面上有部分綠色熒光的BMSCs(16.1±5.42)，說(shuō)明標(biāo)記綠色熒光的BMSCs能夠通過(guò)尾靜脈注射歸巢到達(dá)肝臟組織中行使某種功能。

圖2　兩組肝臟中綠色BMSCs

2.3大鼠肝臟中TGF-β1和PDCD4基因表達(dá)情況對(duì)照組肝臟中TGF-β1較高表達(dá)(2.93±0.30)、PDCD4基因低表達(dá)(0.76±0.36)；治療組接受治療2 w后，TGF-β1表達(dá)顯著降低(1.52±0.23)、PDCD4基因表達(dá)顯著提高(3.62±0.24，均P<0.05)。

2.4大鼠肝臟中c-fox蛋白表達(dá)對(duì)照組肝臟中有更高的c-fos蛋白表達(dá)(1.18±0.14)，而治療組在接受BMSCs治療2 w后，c-fos蛋白表達(dá)顯著降低(0.21±0.07，P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3　兩組c-fos的蛋白量

3　討　論

肝癌是我國(guó)常見(jiàn)高發(fā)的惡性腫瘤之一，目前肝癌治療的最有效手段是手術(shù)切除，但對(duì)于無(wú)法進(jìn)行手術(shù)切除及手術(shù)切除預(yù)后不好的病人，仍然需要尋找更好的輔助手段治療〔4〕。近年來(lái)BMSCs由于來(lái)源方便，可由病人自身提供，移植后免疫排斥反應(yīng)低，無(wú)倫理爭(zhēng)議，受到了廣泛的關(guān)注。BMSCs輸注治療的相關(guān)研究很多，如何能夠更好地觀察干細(xì)胞的去向成為研究的關(guān)鍵〔5～7〕。本研究通過(guò)基因手段，將普通的BMSCs改造成為自發(fā)綠色熒光的細(xì)胞，能更準(zhǔn)確地進(jìn)行標(biāo)記、追蹤和觀察干細(xì)胞，為相關(guān)研究提供了新的實(shí)驗(yàn)思路和依據(jù)〔8,9〕。本實(shí)驗(yàn)觀察到，尾靜脈注射后，治療組中的BMSCs能夠歸巢到達(dá)肝臟。這種歸巢機(jī)制十分復(fù)雜，有研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)尾靜脈注射，BMSCs能夠歸巢到心肌梗死老鼠的心肌中，這種歸巢到損傷組織的特性由組織損傷后釋放的多種趨化因子介導(dǎo)〔10〕。

TGF-β1是一種蛋白多肽，具有多種功能，是TGF-β超家族成員之一。在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、炎癥免疫、調(diào)節(jié)和損傷修復(fù)等方面，TGF-β1都發(fā)揮重要作用。在肝細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)方面,TGF-β1具有負(fù)相調(diào)節(jié)作用〔11〕。有研究發(fā)現(xiàn)正常干細(xì)胞無(wú)TGF-β1，而在肝癌細(xì)胞中TGF-β1 mRNA表達(dá)提高，而TGF-β1水平提高也會(huì)促進(jìn)肝癌的進(jìn)一步侵襲和轉(zhuǎn)移〔12〕。本研究發(fā)現(xiàn)，尾靜脈輸注BMSCs，TGF-β1表達(dá)受到抑制，雖然這種抑制并沒(méi)能達(dá)到零，即達(dá)到正常肝臟的零表達(dá)水平，但這種表達(dá)的下調(diào)說(shuō)明BMSCs輸注能夠有效調(diào)節(jié)肝臟中TGF-β1表達(dá)。

PDCD4基因是一種抑癌基因，具有啟動(dòng)eIF4A、eIF4G，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。研究發(fā)現(xiàn)，癌組織中PDCD4表達(dá)下降甚至缺失，提示PDCD4表達(dá)上調(diào)可能是癌癥受到抑制的標(biāo)志之一〔13〕。本研究再一次證明了尾靜脈輸注BMSCs具有一定的治療效果。

原癌基因c-fos在細(xì)胞生長(zhǎng)的靜止期不表達(dá)，在有增生的正常肝組織中也能檢測(cè)到少量表達(dá)，而在癌癥組織的細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)，可作為一種探尋癌癥狀態(tài)的標(biāo)志物。c-fos蛋白可與c-jun蛋白形成二聚體AP-1,進(jìn)一步與DNA結(jié)合參與轉(zhuǎn)錄的過(guò)程〔14〕。本課題研究結(jié)果說(shuō)明通過(guò)BMSCs尾靜脈輸注能夠從mRNA到蛋白水平逆轉(zhuǎn)肝臟細(xì)胞中的癌癥狀態(tài)，這種逆轉(zhuǎn)可能無(wú)法達(dá)到正常水平，但是為無(wú)法接受肝臟切除的病人或接受肝臟切除病人的預(yù)后提供了可能的干預(yù)手段。

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