劉宏偉　孟　巖　金　鳳

(佳木斯大學(xué)第一附屬醫(yī)院，黑龍江　佳木斯　154007)

視神經(jīng)是由視網(wǎng)膜最內(nèi)層神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的部分軸突匯聚形成，當(dāng)視神經(jīng)受到損傷后，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的數(shù)目會(huì)發(fā)生進(jìn)行性減少，從而導(dǎo)致視功能的下降，這種不可逆的視功能損害嚴(yán)重危害了人類的健康〔1〕。視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷(RIRI)是臨床眼科常見的一種疾病，可以損傷視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及內(nèi)核層細(xì)胞，這一過程有多種因素參與〔2〕。神經(jīng)生長因子(NGF)是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中的一員，是感覺神經(jīng)元存活的必需因子〔3〕。在發(fā)育期大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞上存在NGF的特異性受體，不同的受體對NGF的親和力也不同〔4〕。NGF在神經(jīng)元的生長、發(fā)育和分化方面及其再生和功能性表達(dá)等多個(gè)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，還能減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生，但目前NGF對細(xì)胞保護(hù)的具體作用機(jī)制仍不清楚。本研究擬通過大鼠視網(wǎng)膜缺血-再灌注模型探討NGF對RIRI的保護(hù)作用。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用健康無眼疾的SPF級(jí)Wistar大鼠40只，雌雄各半，體重200～250 g，購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部〔SCXK(黑)2013-001〕；實(shí)驗(yàn)前在佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)。正常飼養(yǎng)，正常光照。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑水合氯醛購自天根生化科技有限公司；NGF、酒精、甲醛溶液、磷酸鹽緩沖液(PBS)購自北京賽馳生物科技有限公司；SABC免疫組化試劑盒、c-fos和c-jun多克隆抗體均購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司；其他實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥將40只SPF級(jí)健康成年Wistar大鼠隨機(jī)分為4組，分別為正常組、模型組、NGF 500 BU組和NGF 1 000 BU組，每組10只，雌雄各半。腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉0.04 g/kg(20 g/L)麻醉，眼內(nèi)滴入2滴1%鹽酸丁卡因角膜表面麻醉，治療組大鼠的右眼分別注射NGF 500 BU/眼和1 000 BU/眼；正常組和模型組大鼠左右眼、治療組大鼠左眼注射同體積生理鹽水；每天1次，連續(xù)4 d，第2 ～4次給藥前用乙醚輕麻。于首次給藥30 min后模型組和治療組大鼠進(jìn)行視網(wǎng)膜缺血-再灌注造模。

1.3.2視網(wǎng)膜缺血-再灌注模型制備參照已有試驗(yàn)方法〔5〕，選用一次性4號(hào)針頭自角膜緣刺入大鼠右眼前房，避開血管叢，針頭連接生理鹽水進(jìn)行灌注，升高眼壓至16 kPa，灌流60 min后抽出針頭，輕壓角膜緣放出房水，眼壓恢復(fù)正常，出現(xiàn)血流再灌注；同時(shí)隨著眼壓下降，眼球變軟，視網(wǎng)膜充血，瞳孔出現(xiàn)紅光反射；滴加抗生素眼藥后放回飼養(yǎng)籠。術(shù)后第2天觀察大鼠的反應(yīng)，無術(shù)眼感染，角膜渾濁，晶狀體混濁，瞳孔對光反射存在，則實(shí)驗(yàn)動(dòng)物建模成功。

1.3.3取材及組織固定于實(shí)驗(yàn)第5天時(shí)將各實(shí)驗(yàn)組大鼠斷頭處死，摘取眼球后置于生理鹽水中沖洗，后置于1%戊二醛和10%甲醛混合溶液中固定，后將眼球自上而下縱切至瞳孔中央，再向內(nèi)、外各成120°夾角切成三等分，然后在鼻側(cè)、顳側(cè)、下側(cè)各縱行切取一條組織，制成蠟塊〔6〕，留存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4相關(guān)指標(biāo)計(jì)算通過顯微鏡觀察記錄視網(wǎng)膜神經(jīng)部九層總厚度(簡稱視網(wǎng)膜厚度)、視網(wǎng)膜厚度比(損傷眼/正常眼)、內(nèi)核層厚度、內(nèi)核層厚度比(損傷眼/正常眼)。以正常對照眼(左眼)的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)為100%，計(jì)算損傷眼(右眼)正常神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、變性神經(jīng)節(jié)細(xì)胞與壞死神經(jīng)節(jié)細(xì)胞所占的百分率。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及t檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1NGF對缺血大鼠視網(wǎng)膜萎縮的影響對照組大鼠右眼在發(fā)生缺血-再灌注損傷后5 d時(shí)，可見明顯的視網(wǎng)膜萎縮變化，具體表現(xiàn)為視網(wǎng)膜厚度比減少(P<0.01)，內(nèi)核層變薄(P<0.05)。然而，經(jīng)過NGF治療后，大鼠右眼缺血-再灌注損傷得到明顯修復(fù)(P<0.01)。治療組NGF 1 000 BU組大鼠右眼視網(wǎng)膜厚度比和內(nèi)核層厚度比與正常組比較接近，但仍明顯低于正常組，見表1。

2.2NGF對大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺血壞死的保護(hù)作用模型組大鼠右眼在發(fā)生缺血-再灌注損傷后5 d時(shí)，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)生明顯變性壞死，正常神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著減少(P<0.05)。與模型組比較，治療組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)變性和壞死的情況得到明顯修復(fù)(P<0.01)，見表2。

表1　NGF對缺血大鼠視網(wǎng)膜萎縮的影響

與模型組比較:1)P<0.01;與正常組比較:2)P<0.05,3)P<0.01，下表同

表2　NGF對缺血大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的影響及其病變分布

3　討　論

RIRI在臨床上是一種常見的病理生理過程，比如視網(wǎng)膜動(dòng)脈阻塞、青光眼等疾病均可造成RIRI〔7,8〕。這一過程會(huì)嚴(yán)重?fù)p傷視網(wǎng)膜的結(jié)構(gòu)和功能，使視網(wǎng)膜出現(xiàn)萎縮、內(nèi)核層變薄的病理變化，同時(shí)還可以引起神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的變性和壞死，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。NGF是一種蛋白質(zhì)，是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中的一員，是感覺神經(jīng)元存活的必需因子〔3〕，在發(fā)育期大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞上存在NGF的特異性受體，存在高親和力和低親和力之分〔4〕。NGF在神經(jīng)元的生長、發(fā)育和分化方面及其再生和功能性表達(dá)等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，還能減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生，但目前NGF對細(xì)胞保護(hù)的具體作用機(jī)制仍不清楚。

研究發(fā)現(xiàn)，NGF可以通過刺激視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長和增殖，促進(jìn)視神經(jīng)處血管管腔的形成，從而促進(jìn)新生血管的形成〔9〕。Tanaka 等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞可以主動(dòng)分泌和釋放NGF，進(jìn)一步確認(rèn)了體內(nèi)NGF的產(chǎn)生與血管內(nèi)皮細(xì)胞密切相關(guān)。此外，Lad等〔11〕研究還發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生并釋放NGF時(shí)，體內(nèi)還會(huì)出現(xiàn)NGF的高親和受體TrkA和低親和受體P75NTR的分泌和釋放，從而起到促進(jìn)體內(nèi)NGF充分利用，進(jìn)一步促進(jìn)視網(wǎng)膜血供的恢復(fù)，修復(fù)視神經(jīng)的損傷。Myung-Jin等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)NGF可促進(jìn)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞和人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞體外增殖和遷移，表現(xiàn)出劑量效應(yīng)關(guān)系，這一研究進(jìn)一步說明了NGF具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和促進(jìn)血管生長的作用。牛膺筠等〔7〕研究顯示，缺血再灌注損傷24 h后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量明顯減少。本研究提示NGF具有防止缺血損傷引起的視網(wǎng)膜萎縮的效果；另外，內(nèi)核層主要由雙極細(xì)胞構(gòu)成，眼睛缺血損傷可明顯導(dǎo)致內(nèi)核層變薄，提示雙極細(xì)胞數(shù)量明顯減少，本研究顯示NGF能夠有效對抗這一損傷，并表現(xiàn)出對雙極細(xì)胞生長和增殖的促進(jìn)作用。由于視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞對缺血造成的損傷極為敏感，并占節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞數(shù)的90%以上，在缺血-再灌注這一病理過程中會(huì)出現(xiàn)變性和壞死表現(xiàn)，本研究提示NGF對視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞由于缺血造成的損傷具有較強(qiáng)修復(fù)和保護(hù)作用。

1王棟,劉子瑞,劉宏偉,等.CNTF與NGF對視神經(jīng)損傷模型大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的影響〔J〕.黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2014;37(6):61-2,65.

2Perlman JI,Mccole SM,Pulluru P,etal.Disturbances in the distribution of neurotransmitters in the rat retina after ischemia〔J〕.Curr Eye Res,1996;15:589-96.

3Levi-Montalcini R，Hamburger V.A diffusible agent of mouse sarcoma producing hyperplasia of sympathetic ganglia and hyperneurotization of viscera in the chick embryo〔J〕.J Exp Zool,1953;123:233-87.

4Zanellato A,Comell MC,Dal TR,etal.Developing rat retinal ganglion cells express the functional NGF receptor p140trka〔J〕.Dev Biol,1993;159(1):105.

5Roy J,Blazar BR,Ochs L.The tissue expression of cytokine in human acute cutaneous graft-versus-host disease〔J〕.Transplantation,1995;60:343-8.

6王軍志,饒著明,吳勇杰.神經(jīng)生長因子對大鼠視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用〔J〕.中國生物制品學(xué)雜志,1998;11(2):107-9.

7牛膺筠,趙穎,賈新國,等.視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后HSP70、NF-KB的表達(dá)和細(xì)胞凋亡的關(guān)系〔J〕.眼科研究,2005;23(4):377-9.

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9王丁丁,于強(qiáng),陳子林,等.神經(jīng)生長因子對人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響〔J〕.中山大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)科學(xué)版),2010;31(1):45-9.

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11Lad SP,Peterson DA,Bradshaw RA,etal.Individual and combined effects of TrkA and p75NTR nerve growth factor (NGF) receptors:a role for the high affnity receptor site〔J〕.J Biol Chem,2003;278(27):24808-17.

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