尚　林　李建菊　尚　軍

(青海省紅十字醫(yī)院藥劑科，青?！∥鲗帯?10008)

《本草綱目》記述：“鎖陽(yáng)性溫、味甘、無(wú)毒、有補(bǔ)腎、益精血、潤(rùn)燥養(yǎng)精治痿弱之用”。臨床用鎖陽(yáng)補(bǔ)陽(yáng)氣，治陽(yáng)痿精虛，陰衰血竭，老年氣弱陰虛，大便燥結(jié)等。近年研究證明，它還有防癌、抗癌，免疫調(diào)節(jié)，延緩衰老，對(duì)防治心血管疾病有明顯效果〔1,2〕。鎖陽(yáng)含有黃酮類(lèi)、三萜類(lèi)、甾體類(lèi)、多糖類(lèi)、揮發(fā)性成分等多種活性成分〔3,4〕。近年來(lái)有關(guān)鎖陽(yáng)功能性保健品及藥品的研發(fā)越來(lái)越受到人們的關(guān)注，本研究通過(guò)HPD-450型大孔吸附樹(shù)脂層析柱富集純化鎖陽(yáng)多糖，采用D-半乳糖小鼠衰老模型，觀察不同劑量鎖陽(yáng)多糖對(duì)小鼠衰老的影響。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料昆明種小鼠，清潔級(jí)，6～8周齡，體重(20±2)g，購(gòu)于青海省地方病研究中心〔實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證 SCXK(青)2005-0001〕；雌雄各半，分籠飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，自由進(jìn)食和飲水。Bio-Rad XMARK全自動(dòng)酶儀〔伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司〕；高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf)。鎖陽(yáng)購(gòu)于青海省西寧九康藥業(yè)有限公司；D-半乳糖〔天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司(批號(hào)：20140326)〕；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶(GSH-ST)、谷胱甘肽還原酶活性系數(shù)(GRAC)、丙二醛(MDA)、過(guò)氧化氫(H2O2)、超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)試盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2鎖陽(yáng)多糖的制備將鎖陽(yáng)粉碎后，過(guò)100目篩，甲醇脫脂。藥渣揮盡甲醇，以水為提取溶劑按料液比1∶6水浴回流3次，每次3 h，合并水提液，濃縮至原體積的1/3。加入85%的乙醇溶液，靜置24 h，4 000 r/min離心，收集沉淀，沉淀經(jīng)適量蒸餾水溶解后反復(fù)凍融，除蛋白，減壓濃縮，60℃真空干燥，得深棕色鎖陽(yáng)粗多糖。將上述鎖陽(yáng)粗多糖配制成100 mg/ml水溶液，經(jīng)HPD-450型大孔吸附樹(shù)脂層析柱富集純化，70%乙醇洗脫，減壓回收溶劑，得灰白色鎖陽(yáng)多糖，以葡萄糖為對(duì)照品，分光光度法測(cè)得含量為72.4%。

1.3動(dòng)物分組及造模給藥將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分成6組，每組10只，雌雄各半，分別為正常對(duì)照組、衰老模型組、鎖陽(yáng)多糖低劑量組(100 mg/kg)、中劑量組(200 mg/kg)、中高劑量組(400 mg/kg)和高劑量組(800 mg/kg)。衰老模型組和鎖陽(yáng)多糖各劑量組每天均頸背部皮下注射D-半乳糖(500 mg/kg)；正常對(duì)照組頸背部皮下注射等量的0.9% 氯化鈉溶液，造模1 w后試藥組同時(shí)灌胃給予不同劑量鎖陽(yáng)多糖；正常對(duì)照組和衰老模型組蒸餾水灌胃，連續(xù)給藥49 d。期間各組小鼠每7天稱(chēng)重1次，按體重確定相應(yīng)的給藥量。

1.4生理指標(biāo)測(cè)定末次給藥后，實(shí)驗(yàn)小鼠禁食不禁水12 h，稱(chēng)重。眼球取血，分離血清，存放于4℃冰箱，備用。按南京建成試劑盒說(shuō)明分別測(cè)定血清中GSH-Px、GSH-ST、SOD、H2O2、MDA、T-AOC和GRAC等指標(biāo)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1各組小鼠體征和行為比較造模前各組小鼠皮毛光亮、活潑、納食正常。造模1 w后，與正常對(duì)照組相比，各組小鼠食欲減退、形體消瘦、體重減輕，毛色灰暗、豎毛，活動(dòng)減少，呈現(xiàn)明顯的衰老體征。給藥后，隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，與衰老模型組相比，鎖陽(yáng)多糖各劑量組小鼠皮毛較光亮、活潑、納食正常，與正常對(duì)照組小鼠相比，行為體征無(wú)明顯差異。

2.2各組血清抗氧化指標(biāo)比較見(jiàn)表1。與正常對(duì)照組比較，衰老模型組血清GSH-Px、T-AOC、SOD、GSH-ST活性均顯著降低(P<0.01)，而GRAC、MDA及H2O2含量均顯著升高(P<0.01)。與衰老模型組比較，鎖陽(yáng)多糖低劑量組H2O2含量顯著降低(P<0.01)；T-AOC、SOD、GSH-ST活性顯著升高(P<0.01)；中劑量組、中高劑量組及高劑量組GRAC、MDA及H2O2含量顯著降低(P<0.05或P<0.01)；而GSH-Px、T-AOC、SOD、GSH-ST活性與衰老模型組比較均顯著升高(P<0.05或P<0.01)。

表1　各組血清抗氧化指標(biāo)水平比較

與衰老模型組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

3　討　論

衰老是多種因素綜合作用的結(jié)果，是機(jī)體生理、病理過(guò)程和生化反應(yīng)的綜合體現(xiàn)，是體內(nèi)外各種綜合因素共同作用的結(jié)果。目前有關(guān)衰老機(jī)制的代表性學(xué)說(shuō)有自由基學(xué)說(shuō)、非酶糖基化學(xué)說(shuō)等。自由基學(xué)說(shuō)是具有代表性的衰老學(xué)說(shuō)之一，該理論認(rèn)為，隨著年齡的增長(zhǎng)，體內(nèi)自由基平衡體系逐漸被破壞，造成自由基過(guò)剩。過(guò)量自由基可通過(guò)過(guò)氧化作用攻擊細(xì)胞膜及核酸、蛋白質(zhì)和酶類(lèi)等生物大分子，引起細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，核酸及蛋白質(zhì)分子交聯(lián)，DNA基因突變或復(fù)制異常及生物酶活力下降，最終導(dǎo)致細(xì)胞功能?chē)?yán)重受損以致衰老、死亡〔5,6〕。非酶糖基化學(xué)說(shuō)認(rèn)為生理?xiàng)l件下，葡萄糖能與蛋白質(zhì)、氨基酸和多肽中的氨基發(fā)生反應(yīng)生成阿馬多里，可降解成不飽和醛酮類(lèi)的中間產(chǎn)物，這些中間產(chǎn)物進(jìn)而與蛋白質(zhì)和氨基酸中的氨基發(fā)生交聯(lián)共軛造成蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷，是導(dǎo)致衰老的主要原因，它們能使血管、肺、腎臟等器官提前老化。因?yàn)樘腔磻?yīng)本身的速度相當(dāng)慢，糖基化的許多實(shí)驗(yàn)是在有氧氣的條件下完成的，與氧自由基相關(guān)的氧化過(guò)程可加速和促進(jìn)糖基化反應(yīng)〔7〕?？寡趸瘎┮云淝宄杂苫δ?，防止自由基破壞生物大分子的特性，而作為延緩衰老的藥物〔8〕。

多糖廣泛存在于生物體中，它不僅是維持生命的基本物質(zhì)之一，而且現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，多糖具有廣泛的生理活性及藥用價(jià)值，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗輻射、抗病毒、抗衰老、抗胃潰瘍、抗凝血等活性。鎖陽(yáng)文獻(xiàn)報(bào)道，鎖陽(yáng)粗多糖咀嚼片及鎖陽(yáng)水提醇沉物咀嚼片可通過(guò)調(diào)節(jié)衰老動(dòng)物的免疫功能及影響脂質(zhì)過(guò)氧化發(fā)揮抗衰老作用〔9，10〕。

過(guò)量的D-半乳糖在醛糖還原酶催化下還原成半乳糖醇，進(jìn)而影響細(xì)胞正常滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙，代謝紊亂，破壞并消耗機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)，從而造成機(jī)體自由基過(guò)剩，生物大分子氧化損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞功能?chē)?yán)重〔11〕。GSH-Px、GSH-ST、SOD及T-AOC活性高低的變化反映了機(jī)體抗氧化能力的大小，活性越高，抗氧化能力越強(qiáng)；核黃素在體內(nèi)以黃素腺聚嘌呤二核苷酸(FAD)的形式與酶蛋白結(jié)合成各種黃素蛋白，作為電子轉(zhuǎn)移系統(tǒng)參與氧化還原過(guò)程，核黃素缺乏時(shí)，GRAC迅速增高，GRAC的水平能反映機(jī)體核黃素營(yíng)養(yǎng)吸收及利用的能力；而H2O2及MDA含量的高低反映了機(jī)體自由基累積及脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的程度。

本研究表明D-半乳糖誘導(dǎo)小鼠衰老與機(jī)體抗氧化防御體系障礙，核黃素營(yíng)養(yǎng)吸收與利用能力降低及自由基累積和脂質(zhì)過(guò)氧化損傷加重有關(guān)。鎖陽(yáng)多糖抗衰老作用可能與其提高GSH-Px、T-AOC、SOD、GSH-ST等抗氧化酶活性，減少M(fèi)DA等脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，增強(qiáng)機(jī)體清除自由基的能力，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，改善機(jī)體對(duì)核黃素營(yíng)養(yǎng)的吸收及利用能力有關(guān)，且呈現(xiàn)量效依賴(lài)關(guān)系。

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