粟勝勇　李妮娜　覃忠亮　趙　駿　陳　霞　邱　菊　黃云龍

(廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣西　南寧　530023)

艾灸可使類風濕關(guān)節(jié)炎(RA)家兔滑膜組織的信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)3基因表達下降，并通過調(diào)控STAT5基因表達，良性調(diào)控Janus激酶(JAK)-STAT信號通路。同時，文獻報道 STAT3 基因表達下降，可有效緩解關(guān)節(jié)炎癥狀〔1〕。麥粒灸是灸法中的一種，治療神經(jīng)根型頸椎病(CSR)具有確切的療效，且目前臨床治療量多選擇5壯〔2～4〕，缺乏麥粒灸治療本病量效關(guān)系的相關(guān)研究。本研究擬評價JAK-STAT 信號轉(zhuǎn)導通路途徑對麥粒灸干預CSR的量效關(guān)系。

1　材料與方法

1.1動物及分組由廣西醫(yī)科大學動物實驗中心提供的，生產(chǎn)批號為：SCXK桂2014-0002，SPF級Wistar大鼠60只，體重(250±20)g，隨機分為正常組、模型組、麥粒灸3壯組、麥粒灸6壯組、麥粒灸9壯組各12只，雌雄各半。動物在實驗前適應性馴養(yǎng)1 w。

1.2主要試劑和儀器試劑：蘇木素(北京中杉金橋)，鹽酸、二甲苯、無水乙醇(天津永大)，磷酸鹽緩沖液(PBS，河北博海生物)，氨水(北京中杉金橋)，切片石蠟(北化康泰)，抗原修復液(河北博海生物)，中性樹膠(河北博海生物)等。儀器：蓋玻片(重慶化玻廠)，超凈工作臺(蘇州，BCM-1000)，洗板機(美國BIO-TEK，型號ELx50)，微量震蕩器(無錫縣金城儀器廠，型號WZS-Ⅲ型)，顯微鏡(日本，BX51T-PHD-J11)，倒置照相顯微鏡(日本，Olympus CK2)，互補金屬氧化物半導體(CMOS)(日本奧林巴斯)，多功能真彩色細胞圖像分析管理系統(tǒng)(美國Media Cybernetics公司Image-Pro Plus)等。

1.3造模方法參照竇夏睿等〔5〕法進行，大鼠麻醉用10%水合氯醛溶液，按0.35 ml/100 g劑量腹腔注射，待麻醉后俯臥位固定，以手觸下頸部附近最高棘突(T2)中心點，將大鼠頸部及上背部毛采用剃須刀剃凈，常規(guī)消毒后，由此向上于背部正中線做3 cm左右切口，逐層鈍性分離皮下組織、頸后部肌群(盡量減少對肌肉組織的大面積破壞)，直至C6～T2左側(cè)椎弓充分暴露，刮凈其表面肌肉和韌帶等組織，用顯微鑷輕輕挑開C7和T1，C6和C7椎間隙的黃韌帶和結(jié)締組織，用尖嘴蚊式鉗輕輕鉗開C7左側(cè)椎弓，暴露脊髓，用眼科神經(jīng)剝離子將脊髓輕推至右側(cè)，再用顯微外科鑷將大約1.5 cm長，直徑0.5 mm的尼龍漁線輕輕沿脊髓縱軸放至C6、C7、T1神經(jīng)根腋下(漁線經(jīng)過酒精浸泡，無菌干燥后再浸泡至0.1%的多聚賴氨酸溶液中，以增加其組織黏附性)，插線時注意漁線不要過度下壓，以免碰破椎靜脈叢導致椎管內(nèi)大量出血，最后逐層關(guān)閉傷口，縫合。模型鼠建立后，大鼠表現(xiàn)動作不活躍。如有外在的驚動時，只能用右上肢及雙下肢緩慢爬行，左上肢緊貼胸前，不敢觸地，肘關(guān)節(jié)、腕關(guān)節(jié)不活動，第2、3趾緊縮。同時，用棉簽輕觸C7神經(jīng)根分布區(qū)，模型表現(xiàn)為身體迅速躲閃，并持續(xù)不斷地嘶叫。

1.4麥粒灸治療麥粒灸3壯組、6壯組、9壯組選用南陽綠瑩艾草生物制品有限公司出廠的陳年艾絨，將艾絨搓成直徑約0.5 cm，高約0.5 cm的圓錐形艾炷，參照大鼠穴位圖譜〔6〕選取大椎穴，并將穴位皮膚毛發(fā)用刀片刮凈，涂少許萬花油，將艾炷置于大鼠穴位皮膚上點燃，灸至大鼠發(fā)出連續(xù)尖叫聲，并出現(xiàn)掙扎等逃避行為時用鑷子將艾炷取下，為1壯，1次/d，連續(xù)干預7 d。

1.5標本取樣與處理動物于造模艾灸干預 7 d后，分別處死大鼠，取出壓線段脊柱，掀開背側(cè)椎板(避免壓傷脊髓)，選用小于0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm組織塊，經(jīng)過4%多聚甲醛進行固定后剝?nèi)ゼ顾杓吧窠?jīng)根周圍骨質(zhì)及肌肉成分石蠟包埋，在脊髓發(fā)出神經(jīng)根的部位做5 μm厚連續(xù)切片，均采用免疫組織化學SABC染色法分別進行免疫球蛋白(Ig)G染色，進行JAK1、STAT3免疫組化測定。

1.6指標檢測方法采用免疫組化方法測定：取脊髓神及經(jīng)根組織放入4%多聚甲醛溶液中固定，蠟塊組織切片厚度約5 μm，防脫切片經(jīng)過常規(guī)脫蠟、脫水；修復抗原，滴加封閉液；根據(jù)組化試劑盒步驟進行操作，光鏡下觀察及多功能真彩色細胞圖像分析管理系統(tǒng)觀察等。用已知陽性切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照，采用半定量計分方法計算最終顯色指數(shù)。

1.7統(tǒng)計學方法應用SPSS17.0軟件進行t檢驗、q檢驗。

2　結(jié)　果

模型組JAK1、STAT3表達均顯著高于正常組(均P<0.001)。不同灸量麥粒灸組JAK1、STAT3表達均顯著低于模型組(P<0.05)；麥粒灸6壯組JAK1、STAT3表達均顯著低于麥粒灸3壯組、9壯組(P<0.01)；麥粒灸3壯組與9壯組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1　各組壓線處脊髓及神經(jīng)根組織JAK1、STAT3表達比較個/視野)

與模型組比較：1)P<0.05；與麥粒灸6壯組比較：2)P<0.01；與正常組比較：3)P<0.001

3　討　論

JAK-STAT轉(zhuǎn)導通路系統(tǒng)是眾多細胞因子信號轉(zhuǎn)導的共同途徑，廣泛參與細胞增殖、分化、凋亡及炎癥等過程〔7〕，與CSR疼痛機制密切相關(guān)的多種炎性細胞因子，如前列腺素(PG)E2、環(huán)氧化酶(COX)-2、白細胞介素(IL)-6、IL-8等的表達均都受到JAK-STAT信號通路的調(diào)控。柴立民等〔8〕在膠原誘導性關(guān)節(jié)炎(CIA)模型大鼠中發(fā)現(xiàn)，益氣活血解毒方能夠抑制IL-6介導的JAK/STAT細胞信號通路活性，從而抑制關(guān)節(jié)軟骨及骨質(zhì)的炎性損傷。Hui等〔9〕在研究兩棲動物脊髓損傷和再生中發(fā)現(xiàn)STAT3在急性脊髓損傷后表達增高。Dominguez 等〔10〕研究表明在外周神經(jīng)損傷后脊髓小膠質(zhì)細胞中JAK-STAT3通路激活，其激活可能與外周神經(jīng)損傷后的疼痛相關(guān)。以上研究提示JAK-STAT 信號轉(zhuǎn)導通路可能是相關(guān)因子信號轉(zhuǎn)導的重要通路。實驗發(fā)現(xiàn)〔11，12〕艾灸可顯著降低實驗性RA家兔滑膜液炎癥相關(guān)細胞因子的含量，降低實驗性RA家兔滑膜組織JAK1、JAK2，STAT1、STAT4的基因表達，認為艾灸對動物模型滑膜細胞JAK-STAT 信號通路中相關(guān)信號分子表達的有效調(diào)控可能是其實現(xiàn)抗炎效應的重要分子機制之一。目前針對不同灸量麥粒灸的研究發(fā)現(xiàn)〔13〕，采用艾條、大艾炷、小艾炷治療3種不同的灸量灸法進行調(diào)治原發(fā)性痛經(jīng)，結(jié)果證實，3種治療方法均能有效緩解疼痛，提高療效；其中艾炷可顯著提高患者的皮溫耐受性，降低患者穴位皮阻，提高患者對疼痛的耐受性。研究表明〔14〕不同灸量麥粒灸對急性高血脂狀態(tài)大鼠均具有普遍性調(diào)節(jié)效應，其中降低甘油三酯方面 6壯和 9壯的效應最佳，升高高密度脂蛋白膽固醇方面 3壯和藥物的效應更優(yōu)。大椎穴為陽脈之海，是六陽經(jīng)的交會穴，又為督脈之穴，是溫陽之重穴，是調(diào)節(jié)一身陽氣的樞紐，對應CSR癥狀表現(xiàn)部位頸部疼痛、僵硬，上肢的放射痛、麻木等，恰與督脈、足太陽、足少陽及手三陽經(jīng)循行支配部位吻合，取大椎即能一穴遍通上述諸經(jīng)，直達病所。本實驗研究結(jié)果表明，CSR模型大鼠脊髓及神經(jīng)根組織JAK1、STAT3細胞因子表達增加；不同灸量的麥粒灸可能通過JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導通路激活，起到調(diào)節(jié)CSR脊髓或神經(jīng)根損傷后JAK1、STAT3細胞因子表達的作用。本實驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)麥粒灸6壯組在干預CSR時療效最佳。

1De Hooge AS，van de Loo FA，Koenderes MI，etal.Local activaion of STAT1 and STAT3 in the inflamed synovium during zymosan-induced arthritis：exacerbation of jiont inflammation in STAT1 gene-knockout mice〔J〕.Arthritis Rheum，2004；50(66)：2014-23.

2狄忠，姜碩，林咸明，等.針刺配合麥粒灸治療頸椎病頸痛近期及遠期療效評價〔J〕.中國針灸，2014；34(4)：325-8.

3陳麗婷.麥粒灸和溫和灸治療神經(jīng)根型頸椎病的臨床療效對比研究.〔D〕.廣州：廣州中醫(yī)藥大學，2015.

4尹建平.針刺配合麥粒灸對頸椎病頸痛患者頸部壓痛閾的影響〔J〕.臨床醫(yī)學研究與實踐，2016；1(9)：55-6.

5竇夏睿，孫建寧，王威，等.中藥復方頸舒片對大鼠神經(jīng)根型頸椎病模型感覺功能的影響〔J〕.中國藥學雜志，2007；42(8)：578-81.

6華興邦，周浩良.大鼠穴位圖譜的研制〔J〕.實驗動物與動物實驗，1991；(1)：1-5.

7薛翔，劉紅梅，邵旦兵，等.JAK/STAT 信號通路調(diào)節(jié)機制的研究進展〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2015；15(11)：2161-5.

8柴立民，董玢，婁利霞，等.益氣活血解毒方對膠原誘導性關(guān)節(jié)炎大鼠Jak/Stat信號通路相關(guān)因子表達的影響〔J〕.中華中醫(yī)藥雜志(原中國醫(yī)藥學報)，2015；30(9)：3364-7.

9Hui SP，Sengupta D，Lee SG，etal.Genome wide expression profiling during spinal cord regeneration identifies comprehensive cellular responses in Zebrafish〔J〕.PLoS One，2014；9(1)：e84212.

10Dominguez E，Rivat C，Pommier B，etal.JAK/STAT3 pathway is activated in spinal cord microglia after peripheral nerve injury and contributes to neuropathic pain development in rat〔J〕.J Neurochem，2008；107(1)：50-60.

11劉旭光，房翳恭，余曙光，等.艾灸對實驗性RA家兔關(guān)節(jié)滑膜液FGF、EGF、PDGF含量的影響〔J〕.中醫(yī)藥學刊，2006；24(3)：428-9.

12楊馨，李繼書，楊慎峭，等.艾灸對實驗性類風濕性關(guān)節(jié)炎家兔滑膜細胞JAK-STAT信號通路影響的研究〔J〕.針刺研究，2007；32(2)：75-82.

13劉春燕，張曉慧.不同灸量灸法對原發(fā)性痛經(jīng)療效的影響〔J〕.臨床醫(yī)藥實踐，2010；19(8B)：1121-2.

14張細柳，王士超，王耀帥，等.不同灸量麥粒灸調(diào)節(jié)血脂效應的比較研究〔J〕.中醫(yī)雜志，2011；52 (5)：413-5.