符　婕　白　雪　楊琳紅　陳立平　魏　宏　李　晶　齊亞靈　王偉群

(佳木斯市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，黑龍江　佳木斯　154002)

N-Myc下游調(diào)節(jié)基因(NDRG)家族是原癌基因N-myc下游調(diào)控基因，共包括4個(gè)成員，分別為NDRG1、NDRG2、NDRG3 和NDRG4。近年來(lái)的研究表明，NDRG成員在腫瘤的發(fā)生與演進(jìn)中發(fā)揮重要的作用，并且發(fā)現(xiàn)同一成員可同時(shí)具有腫瘤促進(jìn)和抑制雙重作用，其原因可能是由各成員的組織特異性所決定的〔1〕。本實(shí)驗(yàn)研究NDRG3對(duì)Hela細(xì)胞增殖、遷移的作用及機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及主要材料Hela宮頸癌細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；RPMI1640 培養(yǎng)基及胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；山羊抗NDRG3多克隆抗體購(gòu)置加拿大SANTA CRUZ公司；細(xì)胞遷移(Transwell)小室、細(xì)胞培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板購(gòu)置美國(guó)CORNING公司；趨化因子CXC配體(L)5酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)及細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑(CCK)-8試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司。

1.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染及鑒定將Hela細(xì)胞接種于6孔板中(6×105個(gè)/孔)，細(xì)胞所用培養(yǎng)基為2 ml含10% FBS、無(wú)雙抗的RPMI1640；將孔板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到80%后，更換上述培養(yǎng)基；依照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染；48 h后加入遺傳霉素(G418)進(jìn)行篩選(終濃度為4 ng/μl)；行Western 印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.3CCK-8實(shí)驗(yàn)將親代(Parental)、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染(Mock)、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(Overexpression)Hela細(xì)胞株分別接種于96孔板中(2×103個(gè)/孔)，細(xì)胞所用培養(yǎng)基為100 μl含10% FBS及雙抗的RPMI1640；將孔板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每隔24 h進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn)。CCK-8實(shí)驗(yàn)具體操作：(1)向每孔中加入10 μl CCK-8試劑；(2)37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h；(3)酶標(biāo)儀讀取450 nm處吸光度值。

1.4Transwell實(shí)驗(yàn)將上述3株細(xì)胞分別接種于Transwell小室中(1×104個(gè)/室)，所用培養(yǎng)基為100 μl無(wú)FBS的RPMI1640；將小室置于24孔板各孔，孔板中培養(yǎng)基為600 μl含10%FBS的RPMI1640；將孔板置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；12 h和24 h后用脫脂棉簽擦拭小室內(nèi)表面以去除沒(méi)有遷移的細(xì)胞；結(jié)晶紫染色，沖洗后進(jìn)行拍照、計(jì)數(shù)。

1.5ELISA實(shí)驗(yàn)將上述3株細(xì)胞分別接種于6孔板中(1.5×105個(gè)/孔)，所用培養(yǎng)基為1 ml含10% RPMI1640；將細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后收集培養(yǎng)基上清，按試劑盒操作步驟檢測(cè)CXCL5濃度。

1.6統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS19.0軟件進(jìn)行q檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的鑒定Parental，Mock和Overexpression三組細(xì)胞的NDRG3相對(duì)表達(dá)量分別為0.682±0.179，0.783±0.137和1.312±0.159。Overexpression與Parental、Mock比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，由此說(shuō)明已經(jīng)構(gòu)建了NDRG3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。

2.2過(guò)表達(dá)NDRG3促進(jìn)Hela細(xì)胞的增殖細(xì)胞培養(yǎng)至72 h和96 h，Overexpression組吸光度值明顯高于Parental和Mock組(P<0.05或<0.01)，由此可見(jiàn)，過(guò)表達(dá)NDRG3可促進(jìn)Hela細(xì)胞的增殖能力。見(jiàn)表1。

2.3過(guò)表達(dá)NDRG3促進(jìn)Hela細(xì)胞的遷移細(xì)胞培養(yǎng)至24 h和36 h，Overexpression組遷移細(xì)胞數(shù)明顯多于Parental和Mock組(P<0.05)，由此可見(jiàn)，過(guò)表達(dá)NDRG3可促進(jìn)Hela細(xì)胞的遷移能力。見(jiàn)表2。

表1　過(guò)表達(dá)NDRG3促進(jìn)Hela細(xì)胞的增殖吸光度,n=8)

與Parental和Mock比較：1)P<0.05，2)P<0.01;表2同

表2　過(guò)表達(dá)NDRG3促進(jìn)Hela細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)，n=6)

2.4過(guò)表達(dá)NDRG3促進(jìn)Hela細(xì)胞分泌CXCL5Parental和Mock組CXCL5分泌性蛋白量分別為(86.36±7.73)ng/ml和(87.12±7.39)ng/ml，兩者顯著低于Overexpression組〔(108.58±8.09)ng/ml,P<0.01〕。

3　討　論

NDRG蛋白家族4個(gè)成員(NDRG1、NDRG2、NDRG3和NDRG4)的氨基酸同源性高達(dá)57%～65%，它們最顯著特征是都具有一個(gè)NDR和一個(gè)α/β 水解酶折疊區(qū)域。在功能上，NDRG家族成員可參與細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)等多種過(guò)程，同時(shí)亦在腫瘤中發(fā)揮重要作用〔1〕。研究表明，NDRG1在多種腫瘤如前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和食管鱗狀細(xì)胞癌具有轉(zhuǎn)移抑制功能〔2〕。然而，特異性沉默肝癌細(xì)胞NDRG1的表達(dá)，可抑制細(xì)胞增殖、侵襲和裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，由此可見(jiàn)，NDRG1在肝癌中具有腫瘤促進(jìn)功能〔3〕。Deng等〔4〕報(bào)道轉(zhuǎn)染NDRG2的腫瘤細(xì)胞會(huì)發(fā)生增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力下降的現(xiàn)象。與NDRG1一樣，NDRG4也具有腫瘤促進(jìn)和抑制的雙重作用，一方面在結(jié)腸直腸癌中其可減少癌細(xì)胞的增殖和侵襲〔5〕；而另一方面其又可促進(jìn)成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的增殖與存活〔6〕。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，過(guò)表達(dá)NDRG3基因在顯著促進(jìn)Hela細(xì)胞的增殖和遷移的同時(shí)，還上調(diào)Hela的分泌性趨化因子CXCL5蛋白水平，該結(jié)果與我們先前在前列腺癌中的研究結(jié)果相一致〔7〕。同樣，我們?cè)谥暗难芯恳诧@示CXCL5與NDRG3一樣，均可促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖〔8〕，提示NDRG3/CXCL5軸在腫瘤中的重要作用。在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、炎性細(xì)胞等多種細(xì)胞可分泌趨化因子經(jīng)自分泌和旁分泌途徑參與腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化和發(fā)展進(jìn)程〔9〕?；诖?，本研究推斷，在宮頸癌中上調(diào)NDRG3表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分泌CXCL5進(jìn)入腫瘤微環(huán)境，作為微環(huán)境中的一種活性成分，CXCL5進(jìn)而經(jīng)與腫瘤細(xì)胞，間質(zhì)細(xì)胞、炎性細(xì)胞上的CXCL5受體(CXCR2)作用而發(fā)揮促癌功能。

1Melotte V，Qu X，Ongenaert M，etal.The N-myc downstream regulated gene (NDRG) family：diverse functions，multiple applications〔J〕.FASEB J，2010；24(11)：4153-66.

2Yang X，An L，Li X.NDRG3 and NDRG4，two novel tumor-related genes〔J〕.Biomed Pharmacother,2013；67(7)：681-4.

3Yan X，Chua MS，Sun H，etal.N-Myc down-regulated gene 1 mediates proliferation，invasion，and apoptosis of hepatocellular carcinoma cells〔J〕.Cancer Lett，2008；262 (1)：133-42.

4Deng Y，Yao L，Chau L，etal.N-Myc downstreamregulated gene 2 (NDRG2) inhibits glioblastoma cell proliferation〔J〕.Int J Cancer，2003；106(3)：342-7.

5Melotte V，Lentjes MH，van den Bosch SM，etal.N-Myc downstream regulated gene 4 (NDRG4)：a candidate tumor suppressor gene and potential biomarker for colorectal cancer〔J〕.J Natl Cancer Inst，2009；101(13)：916-27.

6Schilling SH，Hjelmeland AB，Radiloff DR，etal.NDRG4 is required for cell cycle progression and survival in glioblastoma cells〔J〕.J Biol Chem，2009；284 (37)：25160-9.

7Wang W，Li Y，Li Y，etal.NDRG3 is an androgen regulated and prostate enriched gene that promotes in vitro and in vivo prostate cancer cell growth〔J〕.Int J Cancer，2009；124(3)：521-30.

8齊亞靈，王偉群，張建華，等.CXC 趨化因子配體 5 對(duì)前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2014；34(11)：3035-6.

9Cheng ZH，Shi YX，Yuan M，etal.Chemokines and their receptors in lung cancer progression and metastasis〔J〕.J Zhejiang Univ Sci B，2016；17(5)：342-51.