王　瑩　李文媛　尹國華　李智剛　金在順　滕誠毅　孫　平

(牡丹江醫(yī)學(xué)院解剖教研室，黑龍江　牡丹江　157011)

近年發(fā)現(xiàn)性腺類固醇激素睪酮為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后許多病理生理改變提供廣泛的神經(jīng)保護(hù)和治療作用〔1〕。睪酮可通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)行神經(jīng)保護(hù)和防止神經(jīng)元死亡，降低炎癥和自由基表達(dá)，并能夠加速失神經(jīng)軸突再生和功能恢復(fù)〔2〕。有研究表明睪酮還能夠顯著促進(jìn)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)等表達(dá)〔3〕，但其在周圍神經(jīng)再生的作用及其機(jī)制報(bào)道較少。我們前期研究〔4〕已證實(shí)同種異體脫細(xì)胞異體神經(jīng)(ANA)能夠有效橋接坐骨神經(jīng)缺損，但單獨(dú)使用ANA運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)效果并不理想。本研究擬將脂肪源性干細(xì)胞(ADSC)作為種子細(xì)胞植入ANA橋接坐骨神經(jīng)缺損，并聯(lián)合在體內(nèi)具有較強(qiáng)睪酮活性的雄激素二氫睪酮(DHT)治療，探討DHT聯(lián)合ADSC對(duì)坐骨神經(jīng)缺損后小鼠BDNF信號(hào)通路和功能恢復(fù)的影響。

1　材料和方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)參照前期研究方法取小鼠腹部脂肪組織進(jìn)行ADSC分離、培養(yǎng)及傳代〔4〕，2 w后茜草素紅染色鑒定ADSC向成骨誘導(dǎo)的細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞鑒定后取第4代ADSC行PKH26(Sigma公司，美國)染色標(biāo)記〔5，6〕，進(jìn)行體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)。

1.2動(dòng)物模型30只6～8周齡C57BL/6小鼠(雄性15 只，雌性15 只)，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量18～22 g，按體質(zhì)量隨機(jī)分為：①ANA組：采用化學(xué)萃取脫細(xì)胞方法〔5〕制備CD1小鼠ANA，注入100 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)于ANA，橋接長5 mm坐骨神經(jīng)兩斷端間的缺損，n=10；②ADSC組：注入等劑量ADSC(1×106個(gè)/100 μl)于ANA橋接坐骨神經(jīng)缺損，n=10；③DHT + ADSC組：同ADSC組方法進(jìn)行ANA橋接后，皮下給予DHT0.2 ml(含有DHT 0.8 mg密度為4.0 mg/ml的醫(yī)用玉米油溶液，Sigma公司，美國)注射〔7〕，1次/d，給藥1 w，n=10。3組術(shù)后28 d麻醉取材。

1.3坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)參照前期研究方法行SFI檢測〔6〕，術(shù)后28 d，制備1個(gè)塑料通道(8.5 cm寬，50 cm長)，底部放置一張70 g白紙，黑色墨水蘸在小鼠雙側(cè)后足從通道一端行走至另一端，每個(gè)后足印在紙面3～4個(gè)足印，檢測足趾寬度(TS)、足趾長度(PL)及中間足趾寬度(ITS)。

1.4電生理檢測采用經(jīng)顱磁刺激MEP(tcMMEP)方法〔1〕，應(yīng)用Magstim Model 200 磁刺激器(Magstim 公司，英國)和誘發(fā)電位儀(NIHON KOHDEN公司，日本)經(jīng)顱磁刺激運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位觀察小鼠坐骨神經(jīng)損傷后發(fā)生神經(jīng)傳導(dǎo)潛伏期、傳導(dǎo)速度及波幅改變，將電磁線圈置于顱骨激活皮層下組織誘發(fā)tcMMEP反應(yīng)，探查電極置于腓腸肌肌腹，參考電極插入肌腱，接地電極插入尾巴。每只小鼠每側(cè)均檢測3次，每次間隔1 min，結(jié)果取平均值。

1.5Western印跡檢測神經(jīng)移植體內(nèi)DNF表達(dá)及其受體TrkB術(shù)后28 d，小鼠麻醉取ANA沖洗，剝離硬膜放置干冰保存，電泳分離蛋白樣品(20 μg)后轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗：兔抗BDNF抗體(1∶200，Sigma公司，美國)和兔抗TrkB抗體(1∶200，Sigma公司，美國)，4℃過夜，加入二抗(1∶5 000)孵育1 h，使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)(GE Healthcare公司，英國)觀察蛋白印跡。

1.6免疫熒光組化染色將快速分離的ANA置于含4%多聚甲醛固定，30%蔗糖脫水，冰凍切片，常規(guī)免疫組化染色，一抗為兔抗NF200(1∶200，Sigma公司，美國)，二抗為FITC(1∶200，Sigma公司，美國)，熒光顯微鏡下觀察并同時(shí)示蹤PKH26標(biāo)記的ADSC。每張切片400倍鏡下隨機(jī)選取4個(gè)視野檢測光密度(IOD)值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0軟件行t檢驗(yàn)及單因素方差分析。

2　結(jié)　果

2.1ADSC培養(yǎng)與分化原代培養(yǎng)ADSC 8 d后形成的細(xì)胞群落較為密集，ADSC呈多角形或梭形伸展，有鋪路石狀特征。ADSC分化誘導(dǎo)成骨28 d后，可見分化細(xì)胞內(nèi)的鈣沉積茜素紅染色，見圖1。

圖1　ADSC培養(yǎng)與分化(×200)

2.2Western印跡結(jié)果DHT + ADSC組和ADSC組ANA中BDNF及其受體TrkB蛋白表達(dá)較ANA組顯著增高，其中DHT+ADSC組BDNF及其受體TrkB蛋白表達(dá)顯著高于ADSC組(均P<0.001)，見圖2，表1。

表1　各組Western 印跡蛋白相對(duì)表達(dá)

與ANA組比較：1)P<0.05；與ADSC組比較：2)P<0.05，表3同

2.3免疫熒光染色觀察熒光顯微鏡下可見DHT + ADSC組和ADSC組在ANA中段有PKH26標(biāo)記的ADSC，而DHT + ADSC組PKH26陽性表達(dá)顯著高于ADSC組(t=6.715，P<0.001)。免疫熒光法染色NF200檢測神經(jīng)支架中段軸突生成情況，與ADSC組比較，DHT + ADSC組NF200表達(dá)顯著增加(t=22.542，P<0.001)，見圖3，表2。

圖3　術(shù)后4 w ADSC組和DHT + ADSC組神經(jīng)移植體中段PKH26和NF200免疫組化熒光染色(×200)

表2　各組PKH26和NF200的IOD值

與ADSC組比較：1)P<0.05

2.4SFI檢測結(jié)果術(shù)后28 d，與ANA組(-72.32±6.05)和ADSC組(-68.87±7.52)比較，DHT + ADSC組SFI指數(shù)顯著增高(-54.30±5.45，F(xiàn)=24.62，P<0.001)，而ANA組與ADSC組SFI指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.5神經(jīng)電生理檢測與ANA組比較，ADSC組和DHT + ADSC組神經(jīng)傳導(dǎo)速度及波幅顯著增加，而延遲期顯著縮短，其中DHT+ADSC組改善神經(jīng)電生理參數(shù)明顯優(yōu)于ADSC組 (神經(jīng)傳導(dǎo)速度：F=65.22，P<0.05；延遲期：F=14.32，P<0.05；波幅：F=19.65，P<0.05)，見表3。

表3　各組神經(jīng)電生理參數(shù)檢測

3　討　論

目前發(fā)現(xiàn)近端周圍神經(jīng)病變或完全橫斷的預(yù)后普遍較差，運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)緩慢。其中主要原因是適宜神經(jīng)生長的微環(huán)境缺乏，軸突生長底物和神經(jīng)營養(yǎng)因子減少及受損軸突內(nèi)在生長速度太慢，導(dǎo)致再生軸突需較長時(shí)間連接遠(yuǎn)端失神經(jīng)支配的神經(jīng)、不能重新支配靶組織，其功能恢復(fù)并不理想〔8〕。

前期研究發(fā)現(xiàn)〔4，5〕ANA由于脫去了周圍神經(jīng)的細(xì)胞成分，保存了神經(jīng)天然結(jié)構(gòu)，具有較好的組織相容性，能夠?yàn)樯窠?jīng)缺損提供良好的神經(jīng)生長微環(huán)境。而種子細(xì)胞ADSC可合成和分泌大量神經(jīng)營養(yǎng)因子，如神經(jīng)生長因子、血管內(nèi)皮生長因子等，這些促進(jìn)神經(jīng)生長的因子表達(dá)變化提供軸突生長的營養(yǎng)。本研究也再次證實(shí)ADSC能夠促進(jìn)ANA橋接神經(jīng)缺損后功能恢復(fù)，但SFI結(jié)果表明ADSC組神經(jīng)功能恢復(fù)效果并不盡如人意，盡管其SFI有增高趨勢，且有研究證實(shí)〔6，9〕聯(lián)合治療能夠克服多種抑制神經(jīng)軸突再生的因素，較單一治療效果更為明顯。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，睪酮能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元存活，防止皮質(zhì)錐體細(xì)胞損傷誘導(dǎo)的樹突萎縮〔3〕，促進(jìn)腦卒中后早期功能恢復(fù)，并刺激周圍神經(jīng)損傷后運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突的生長〔10〕。而在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，睪酮能夠加速面神經(jīng)、舌下神經(jīng)、坐骨神經(jīng)軸突再生和神經(jīng)切斷后功能恢復(fù)〔2，11〕，但其促進(jìn)軸突再生的機(jī)制尚不明確，本研究證實(shí)DHT治療能夠有效激活BDNF細(xì)胞信號(hào)，這與以往研究結(jié)果相一致〔3〕，其機(jī)制可能是BDNF的表達(dá)是通過鈣依賴的信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)節(jié)，而cAMP反應(yīng)元件(CRE)和cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)參與其信號(hào)通路發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。睪酮已證實(shí)能夠有效激活CRE和CREB，因此，睪酮介導(dǎo)cAMP信號(hào)通路能夠調(diào)控和促進(jìn)BDNF產(chǎn)生〔10〕。本研究推測DHT可能通過激活BDNF細(xì)胞信號(hào)，促進(jìn)移植的ADSC增殖和存活，進(jìn)而促進(jìn)軸突的再生，且DHT聯(lián)合ADSC能夠協(xié)同促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。

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