尹曉剛　張輝芳　李富強(qiáng)

(南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南　南陽　473058)

癲癇是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)慢性疾病，主要是指多種病因造成腦細(xì)胞群異常的超同步化放電而引起的具有發(fā)作性、突然性和暫時(shí)性特征的腦功能紊亂，但其具體發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚〔1,2〕。癲癇在我國的發(fā)病率較高，大約有1 000萬的患者，臨床上一般多采用抗癲癇藥物(AEDs)進(jìn)行治療，治療效果不理想，應(yīng)與癲癇患者的易感性和耐藥性有關(guān)〔3,4〕。研究表明〔5〕，miRNA(miR)-146a可能是癲癇發(fā)生的重要調(diào)控因子，其在炎癥信號(hào)通路中發(fā)揮著重要的作用，但目前關(guān)于miR-146a基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)rs57095329基因多態(tài)性與癲癇易感性關(guān)系的研究卻較少。本研究探討并分析rs57095329位點(diǎn)多態(tài)性與癲癇易感性的關(guān)系。

1　資料與方法

1.1一般資料見表1。2012年2月至2016年12月南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院老年癲癇患者75例為病例組，納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥60歲；②均經(jīng)腦電圖確診；③患者及家屬均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并有肝、腎等重要臟器疾病；②有認(rèn)知功能障礙等精神疾病。同時(shí)按照1∶2配對(duì)選取150例健康志愿者為對(duì)照組，兩組性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1　兩組一般資料比較

1.2實(shí)驗(yàn)方法入試者均于清晨采集空腹靜脈血約5 ml，采用酚氯仿抽提的方法提取外周血白細(xì)胞的總DNA，并測定DNA的純度，并對(duì)含有SNP位點(diǎn)(rs57095329)的片段進(jìn)行擴(kuò)增，引物如下：上游為5′-CGGGGCTGCGGAGAGTCTAG-3′，下游為5′-GGACCCTCTTGCACACGTGTC-3′；擴(kuò)增條件如下：95℃ 10 min后以60℃、15 s進(jìn)行變性、60℃、60 s進(jìn)行退火、72℃ 5 min后30 s進(jìn)行延伸，此為1個(gè)循環(huán)，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完畢后，取5 μl擴(kuò)增產(chǎn)物分別利用限制性內(nèi)切酶XbaI和PciI(美國NEB公司)進(jìn)行酶切，瓊脂糖凝膠電泳后紫外線凝膠成像分析系統(tǒng)拍照并進(jìn)行基因分型，同時(shí)將擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生物技術(shù)中心進(jìn)行基因測序。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t、χ2檢驗(yàn)。樣本代表性采用Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1rs57095329基因型凝膠電泳圖rs57095329位點(diǎn)包括GG、AG和AA型3種基因型，見圖1。

2.2遺傳平衡檢驗(yàn)兩組基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，兩組具有群體代表性，見表2。

M為DNA Marker；1和2為GG型；3和4為AA型；5和6為AG型圖1　rs57095329基因型凝膠電泳

2.3兩組rs57095329基因型和等位基因比較病例組和對(duì)照組rs57095329基因型和等位基因比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

2.4rs57095329基因型與癲癇發(fā)作頻率的關(guān)系rs57095329基因型與老年癲癇患者發(fā)作頻率無相關(guān)性(P>0.05)，見表4。

表4　rs57095329基因型與每月癲癇發(fā)作頻率〔n(%)〕

3　討　論

癲癇患病率較高，是神經(jīng)科僅次于頭痛的第二大疾病〔6，7〕。癲癇的發(fā)病原因有很多，如遺傳因素、顱腦腫瘤、顱腦外傷、心血管疾病、代謝性疾病等，患者發(fā)作后的臨床癥狀也復(fù)雜多樣，常見的為發(fā)作性運(yùn)動(dòng)、感覺、自主神經(jīng)、意識(shí)及精神障礙，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量〔8，9〕。目前臨床上多采用藥物對(duì)癲癇患者進(jìn)行治療和控制，多數(shù)患者在經(jīng)過正規(guī)AEDs治療后可明顯控制癲癇發(fā)作，甚至痊愈，但也有部分患者經(jīng)正規(guī)治療后仍無法控制，成為難治性癲癇〔10〕。目前對(duì)于癲癇的具體發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚，多認(rèn)為與離子通道神經(jīng)遞質(zhì)及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的改變有關(guān)，而難治性癲癇的發(fā)生和機(jī)制可能與癲癇易感性和耐藥性有關(guān)〔11〕。miR是一類重要的內(nèi)源性單鏈非編碼小RNA分子，可調(diào)控細(xì)胞生物的發(fā)育、增殖、分化、代謝、凋亡和應(yīng)激等過程〔12〕。研究表明〔13〕，miR與癲癇的發(fā)生、發(fā)展等過程有密切關(guān)系，其中miR-146a作為免疫和炎癥反應(yīng)的重要調(diào)控因子在這一過程中發(fā)揮著重要的作用。

SNP是一種分子標(biāo)記，在人類基因組中常常密集分布，大約每1 000 bp有一個(gè)SNP位點(diǎn)，而SNP位點(diǎn)的多樣性在疾病關(guān)聯(lián)中分析中常常被廣泛應(yīng)用。研究表明〔14〕，rs570953290是一個(gè)功能性的SNP，位于miR-146a基因的啟動(dòng)子區(qū)域，其多態(tài)性與miR-146a基因的表達(dá)水平密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)rs57095329位點(diǎn)包括GG、AG和AA型3種基因型，這與程衍楊等〔5〕的研究一致，本文提示s57095329位點(diǎn)多態(tài)性與癲癇易感性無相關(guān)性。本研究中，兩組G和A等位基因頻率并無明顯差異，但程衍楊等〔5〕的研究中發(fā)現(xiàn)癲癇組G等位基因頻率顯著高于對(duì)照組，其可能是難治性癲癇發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因子；而Cui等〔15〕的研究顯示A等位基因與降低癲癇發(fā)作的次數(shù)相關(guān)，這與本研究的研究結(jié)果相差很大，其原因可能與入選標(biāo)準(zhǔn)和樣本不同有關(guān)。

本研究分析rs57095329基因型與老年癲癇患者易感性和發(fā)作頻率并無相關(guān)性的原因可能與以下因素有關(guān)：①癲癇的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，大多數(shù)均為多基因遺傳，可能涉及多個(gè)基因共同作用的結(jié)果，而少量樣本并不能覆蓋所有基因；②在與癲癇發(fā)作相關(guān)的基因中可能存在了多個(gè)作用位點(diǎn)，且可能只有其中一部分起到了關(guān)鍵作用；③不同種族和不同地域研究對(duì)象的結(jié)果可能會(huì)出現(xiàn)相關(guān)性不一致的結(jié)果。因此，對(duì)于miR-146a基因的rs57095329位點(diǎn)多態(tài)性與老年癲癇易感性和發(fā)作頻率的相關(guān)性仍需深入研究。

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2Tomson T，Battino D，Bonizzoni E，etal.EURAP study group.Dose-dependent risk of malformations with antiepileptic drugs：an analysis of data from the EURAP epilepsy and pregnancy registry〔J〕.Lancet Neurol，2015;10(7)：609-17.

3張青川.抗癲癇藥物對(duì)患者外周血葉酸及維生素B12的影響〔J〕.實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志，2016;20(1)：153-4.

4李瑞杰，顧家鵬，張學(xué)民，等.5種抗癲癇藥單藥治療新診斷癲癇患者2年保留率比較〔J〕.中國全科醫(yī)學(xué)，2015;18(9)：1037-41.

5程衍楊，何惠，劉奧杰，等.miRNA-146a基因多態(tài)性與兒童癲癇的相關(guān)性研究〔J〕.廣東醫(yī)學(xué)，2016;37(18)：2787-9.

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10徐緩，徐曲榮.抗癲癇藥物對(duì)熱性驚厥相關(guān)癲癇患者發(fā)作控制的效果觀察〔J〕.臨床與病理雜志，2016;36(4)：413-6.

11張虎，杜欣娜，徐敏，等.GABAA受體基因多態(tài)性與癲癇易感性的關(guān)系〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2015;35(19)：5439-41.

12徐冬云.胃癌發(fā)生相關(guān)的miRNA的篩選及miR-196a的功能學(xué)研究〔D〕.上海：第二軍醫(yī)大學(xué)，2015.

13張楠楠，朱喜科.癲癇與微小RNA和生酮飲食的研究進(jìn)展〔J〕.中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志，2014;21(6)：430-3.

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