★張春紅 盧焯明 杜廣亮（.廣州市中醫(yī)醫(yī)院 廣州　5030；.廣州愛博恩婦產(chǎn)醫(yī)院 廣州　5030）

地中海貧血是一種遺傳性溶血性貧血，由于珠蛋白基因的缺陷，使一種或幾種珠蛋白肽鏈合成減少或缺乏，導(dǎo)致血紅蛋白的構(gòu)成成分改變。地中海貧血在我國南方各省比較常見，嚴(yán)重威脅兒童、青少年健康。其治療主要包括輸血、鐵螯合劑、造血干細(xì)胞移以及基因治療等。但是前兩種治療手段存在著內(nèi)皮損傷、傳染病暴露等毒副作用，造血干細(xì)胞移植因干細(xì)胞來源的稀缺及費(fèi)用問題，難以廣泛開展。目前，珠蛋白基因誘導(dǎo)成為β地中海貧血的可行治療手段，以羥基脲為代表的各種誘導(dǎo)西藥有一定療效，但由于該方法存在著骨髓抑制、免疫抑制等風(fēng)險，使其不能在臨床上廣泛使用。本課題組既往的研究采用補(bǔ)氣益精生血中藥方治療β地貧，取得了良好療效［1-2］，但具體分子機(jī)制仍在探討中。目前認(rèn)為，基因治療可激活γ珠蛋白基因，增加γ珠蛋白的表達(dá)，其靶點(diǎn)可能是關(guān)鍵紅系反式作用因子BCL11A及其它相關(guān)紅系轉(zhuǎn)錄因子［3］。本研究運(yùn)用補(bǔ)氣益精生血法治療β地貧患兒，檢測血液學(xué)指標(biāo)以觀察療效，并與羥基脲進(jìn)行隨機(jī)雙盲對照，對用藥后體內(nèi)紅系反式作用因子BCL11A及其它相關(guān)紅系轉(zhuǎn)錄因子如SOX6等的蛋白水平進(jìn)行分析，從而探討中藥起效的分子機(jī)制。

1　資料與方法

1.1研究對象 本研究得到醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，納入2016年1月—2017年6月在廣州市中醫(yī)醫(yī)院就診的β地貧患兒38例?；颊弑救嘶虮O(jiān)護(hù)人知情同意。

診斷標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》（科學(xué)出版社2007年版）中對β-珠蛋白生成障礙性貧血（β地中海貧血）的診斷標(biāo)準(zhǔn)，選擇中間型地貧患者。中醫(yī)辨證參照《中醫(yī)診斷學(xué)》《中醫(yī)證候鑒別診斷學(xué)》和《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》，證屬腎精虧虛、氣血不足者。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡：2～18歲；（2）基因檢查已確診β地中海貧血，符合上述中間型β地貧診斷標(biāo)準(zhǔn)以及中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)；（3）Hb≥60g/L；

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有免疫缺陷，心臟疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)及血液系統(tǒng)其它疾病者；（2）患者12周內(nèi)有輸血或服用其他抗貧血中西藥物者；（3）既往有多種藥物過敏者；（4）既往對藥物治療依從性差者。

納入研究的患兒使用SPSS隨機(jī)數(shù)字生成器按1∶1分別進(jìn)入中藥觀察組及西藥對照組。其中中藥組19例、對照組19例（研究過程中對照組脫落1例）。兩組患兒年齡、性別及 Hb水平無明顯差異（P＞0.05），見表1。

表1　兩組一般資料比較（，n=19）例

表1　兩組一般資料比較（，n=19）例

注：表中兩組年齡的比較，t=1.79，P＞0.05。Hb的比較，t=0.21，P＞0.05。

組別男女年齡（歲）Hb（g/dL）觀察組9105.47±2.2276.15±8.0對照組1096.63±1.7375.63±6.62

1.2研究方法

1.2.1本研究采用雙盲雙模擬法 觀察組予補(bǔ)氣益精生血方口服，方藥組成：黃芪、龜板、黨參、當(dāng)歸，采用中藥配方顆粒劑型（廣東一方制藥有限公司生產(chǎn)，許可證號：粵20110214），1袋均相當(dāng)于各自飲片10g的水提取物。用法與用量：2～6歲患兒以上四種顆粒每次各1袋，6～12歲患兒每次各2袋，12～18歲患兒每次各3袋，均每日1次，混合后沖服，連續(xù)每日用藥。同時加用西藥安慰劑，用法參照西藥對照組中羥基脲片的用法。

西藥對照組采用口服羥基脲治療，齊魯制藥有限公司生產(chǎn)（國藥準(zhǔn)字H37021289），用法用量：10mg/kg/d，每周連用4d，停藥3d。同時加用中藥安慰劑，用法用量參照中藥觀察組。兩組藥物使用的外包裝相同，療程12周。

1.2.2中止和撤出研究標(biāo)準(zhǔn) （1）研究期間出現(xiàn)Hb＜50g/L者；（2）不能堅持治療，或者研究期間使用其它可能影響血液系統(tǒng)的藥物者；（3）出現(xiàn)嚴(yán)重不良事件或不良反應(yīng)者或者安全性指標(biāo)明顯超出參考值范圍者，或者出現(xiàn)嚴(yán)重地貧并發(fā)癥者；（4）對治療藥物過敏者。對于以上（1）者予以輸血，其他情況者給予相應(yīng)處理。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1血液學(xué)指標(biāo) 治療前及治療開始后的第4周、8周、12周，分別取患兒末梢血以檢測血常規(guī)，觀察血紅蛋白（Hb）、紅細(xì)胞總數(shù)（RBC）、紅細(xì)胞平均體積（MCV）、平均血紅蛋白含量（MCH）；治療前及治療12周后分別取患兒靜脈血以手工計數(shù)法進(jìn)行網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)（Ret）；采用堿性血紅蛋白電泳法檢測HbF比例。

1.3.2安全性指標(biāo) 同上檢測血常規(guī)方法，觀察白細(xì)胞總數(shù)（WBC）、中性粒細(xì)胞總數(shù)（NEU）、血小板總數(shù)（PLT）；治療前及治療12周后分別取患兒靜脈血進(jìn)行肝、腎功能測定，觀察血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、谷氨酸?；D(zhuǎn)移酶（GGT）、血清尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）。

1.3.3反式作用因子蛋白水平 以Western Blot檢測BCL11A、SOX6、Myb、KLF1蛋白水平：在治療前及治療滿12周后，兩組參與研究的患兒各抽取外周血4ml，采用不連續(xù)密度梯度離心法分離包含有核紅細(xì)胞在內(nèi)的單個核細(xì)胞（mononuclearcells，MNCs）。以PBS洗滌，提取MNCs細(xì)胞總蛋白并以BCA法定量。SDS-PAGE分離蛋白，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜，各蛋白的單克隆抗體一抗、二抗分別先后與蛋白質(zhì)雜交，以β-actin為內(nèi)參照，使用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒發(fā)光并曝光，通過圖像分析軟件分析目的蛋白條帶的與內(nèi)參照條帶的積分光密度值（integrated optical density，IOD）比值。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)錄入 SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計，計量資料屬正態(tài)分布以表示，同組治療前后差異采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)方差分析及配對t檢驗(yàn)，組間差異采用成組t檢驗(yàn)及協(xié)方差分析。

2　結(jié)果

2.1兩組血常規(guī)指標(biāo)變化的比較 兩組在不同治療時點(diǎn)Hb的變化，均有統(tǒng)計學(xué)意義，兩組治療后Hb相比，沒有明顯差異。觀察組在不同治療時點(diǎn)RBC的變化，有統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

2.2兩組治療前后HbF比例、Ret變化的比較 治療前后自身比較，兩組HbF變化均有統(tǒng)計學(xué)意義。觀察組治療后Ret明顯上升，對照組治療后Ret明顯下降。見表3。

表2　兩組治療前后血常規(guī)指標(biāo)變化的比較（）例

表2　兩組治療前后血常規(guī)指標(biāo)變化的比較（）例

注：治療12周后，兩組RBC的比較，t=14.37，#P＜0.05；兩組 Hb的比較，t=0.25，*P＞0.05；兩組MCV的比較，t=0.79，ΔP＞0.05；兩組MCH的比較，t=0.53，※P＞0.05。

組別nHb（g/L）RBC（x1012/L）MCV/fLMCH/pg觀察組19治療前74.89±2.533.45±0.1867.47±4.9820.82±1.81治療后4周75.78±1.963.61±0.1367.10±4.8921.03±1.41治療后8周83.52±2.563.73±0.1566.93±4.6020.74±1.44治療后12周90.15±2.82*3.96±0.13#67.64±4.09Δ21.61±1.15※F值207.256.041.032.35 P值0.000.000.500.08治療前77.33±8.63.45±0.1566.44±4.2020.61±1.80治療后4周78.0 ±6.623.47±0.1267.31±4.2820.33±2.04治療后8周82.83±4.893.51±0.1365.81±3.1221.05±1.52治療后12周89.88±3.893.47±0.0766.22±3.2221.86±1.27 F值196.71.030.971.07 P值0.000.450.430.40對照組18

表3　兩組治療前后HbF比例、Ret變化的比較（）例

表3　兩組治療前后HbF比例、Ret變化的比較（）例

注：治療前，兩組HbF比例、Ret的比較，無統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05；治療后兩組HbF比例的比較，t=0.12，P＞0.05，治療后兩組Ret的比較，t=4.76，#P＜0.05。

治療前47.40±9.010.042±0.012治療后56.06±6.030.035±0.001 t值17.0613.65 P值0.000.00對照組18

2.3兩組治療前后WBC、NEU、PLT變化比較 觀察組治療前后 WBC、NEU、PLT均無明顯變化，對照組治療后WBC、NEU明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表4。

表4　兩組治療前后WBC、NEU、PLT變化比較（）109/L 例

表4　兩組治療前后WBC、NEU、PLT變化比較（）109/L 例

注：治療前，兩組WBC、NEU、PLT的比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05；與治療前相比，觀察組治療前后WBC、NEU、PLT均無明顯變化，P＞0.05；對照組WBC、NEU明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，*P＜0.05；治療后，兩組WBC的比較，t=7.12，#P＜0.05；兩組NEU的比較，t=13.03，#P＜0.05，兩組PLT的比較，t=0.41，P＞0.05。

組別nWBC NEUPLT觀察組19治療前7.97±0.583.85±0.62251.33±65.07治療后7.92±0.74#3.71±0.49#250.66±46.26 t值0.180.440.32 P值0.850.650.74治療前7.85±0.843.70±0.63254.31±31.06治療后5.54±1.22*1.91±0.33*255.36±17.65 t值19.0020.120.12 P值0.000.000.90對照組18

2.4兩組紅系反式作用因子蛋白水平變化比較 治療后，觀察組BCL11A、SOX6、 Myb水平明顯下降，KLF1無變化。對照組治療前后BCL11A、SOX6、Myb、KLF1水平均無變化。見表5。

表5　兩組紅系反式作用因子蛋白水平變化比較（）

表5　兩組紅系反式作用因子蛋白水平變化比較（）

注：治療前，兩組BCL11A、 KLF1 、SOX6、Myb的比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05；與治療前相比，觀察組治療后的BCL11A、SOX6、Myb明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，*P＜0.05；KLF1無明顯變化，P＞0.05；對照組治療前后BCL11A、SOX6、Myb、KLF1水平均無明顯變化，P＞0.05；治療后，兩組BCL11A的比較，t=8.95，#P＜0.05；SOX6的比較，t=20.16，#P＜0.05；Myb的比較，t=3.89，#P＜0.05，KLF1的比較，t=1.18，P＞0.05。

組別BCL11AKLF1SOX6Myb觀察組治療前0.52±0.100.21±0.020.56±0.140.46±0.09治療后0.27±0.07*0.19±0.03 0.24±0.06*0.33±0.07*t值24.862.0818.3617.63 P值0.000.050.000.00治療前0.53±0.100.21±0.01 0.58 ±0.110.48±0.06治療后0.54±0.11#0.20±0.02 0.58±0.04#0.44±0.10#t值0.700.521.580.96 P值0.480.600.130.34對照組

2.5兩組治療前后肝腎功能（AST、ALT、GGT、BUN、Cr）的比較 見表6。

表6　兩組治療前后肝腎功能變化的比較（）例

表6　兩組治療前后肝腎功能變化的比較（）例

注：兩組肝腎功能未見異常，治療前后兩組肝腎功能的比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05。

組別nAST（U/L）ALT（U/L）GGT（U/L）BUN（mmol/L）Cr（umol/L）觀察組19治療前31.89±2.1530.42±12.3625.78±12.015.32±1.6442.50±10.44治療后30.35±3.4631.65±11.6326.74±10.366.28±1.3844.64±9.06對照組18治療前31.44±2.4730.55±10.9828.33±12.264.93±1.5243.31±9.76治療后31.56±2.8731.49±11.4327.62±11.235.86±1.3245.76±11.32

3　討論

地中海貧血是一種基因遺傳病，在中醫(yī)典籍中無明確記載，本課題組通過對其中醫(yī)證候規(guī)律的研究，擬定了補(bǔ)氣益精生血法為地中海貧血的主要中醫(yī)治法。既往臨床研究［1］證明，采用補(bǔ)氣益精生血法治療小兒β地貧，觀察組患兒的Hb及HbF水平有顯著提高，同時可以改善其他血液學(xué)指標(biāo)及中醫(yī)臨床癥狀，療效優(yōu)于對照組且較安全。國內(nèi)多個研究［4-5］也將黃芪、黨參、當(dāng)歸、山茱萸、何首烏等補(bǔ)腎、益氣、生血的中藥作為治療小兒β地貧的主要藥物，能顯著提高β地貧患兒Hb及HbF水平，改善貧血癥狀。本研究采用補(bǔ)氣益精生血治法與西藥羥基脲進(jìn)行對照，療程3個月，對比了治療前后患兒的血液學(xué)指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，治療后兩組患兒的Hb及HbF顯著上升，兩組相比無明顯差異，觀察組RBC、Ret水平顯著上升，而對照組RBC水平無明顯變化，Ret水平下降，這可能與羥基脲片本身的骨髓抑制有關(guān)。安全性方面，觀察組治療前后的WBC、NEU、PLT水平無明顯變化，對照組治療后WBC、NEU顯著降低，提示中藥觀察組在減輕免疫抑制方面有優(yōu)勢。兩組患兒治療前后肝腎功能均未見異常。

珠蛋白基因誘導(dǎo)是近年來治療β地貧的新方向，正常情況下，γ珠蛋白基因在出生后近乎關(guān)閉，但可以通過藥物進(jìn)行誘導(dǎo)，使其重新激活表達(dá)，以增加胎兒血紅蛋白（fetal hemoglobin，HbF）含量，HbF含量的增加可以在功能上代償正常血紅蛋白的不足，改善組織供氧、緩解臨床癥狀。有研究發(fā)現(xiàn)［6］，通過小干擾技術(shù)使BCL11A 基因表達(dá)沉默后，細(xì)胞內(nèi)γ珠蛋白基因的mRNA水平較未沉默細(xì)胞明顯升高，提示BCL11A 基因?qū)Ζ弥榈鞍谆虮磉_(dá)可能存在負(fù)調(diào)控作用。聶偉業(yè)等［7］采用siRNA阻斷BCL11A基因，結(jié)果顯示可以誘導(dǎo)β地貧患者紅系細(xì)胞γ珠蛋白基因的表達(dá)，顯著增加HbF含量。其原理可能是BCL11A 基因可以特異性地直接調(diào)控γ珠蛋白基因表達(dá)，對HbF成具有直接作用，同時不影響其他紅系轉(zhuǎn)錄因子如GATA -1、NF-E2和EKLF的表達(dá)［8-9］。其他紅系轉(zhuǎn)錄因子，如AKT、SOX6、Myb等，相關(guān)動物試驗(yàn)也提示與HbF的表達(dá)高度相關(guān)［10］。Myb是一種原癌基因，可以通過調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄實(shí)現(xiàn)自身功能，對造血細(xì)胞的分化、增殖和凋亡均有重要作用。對地中海貧血患者的研究發(fā)現(xiàn)，在HbF含量增多的同時，出現(xiàn)了HBS1L和cMyb兩種基因表達(dá)減少，體外實(shí)驗(yàn)也表明，cMyb可以影響γ-球蛋白基因表達(dá)，低表達(dá)的Myb能加速紅細(xì)胞成熟［11］。目前一些研究［12-13］提示，在β-地貧和一些血紅蛋白病的治療中，某些特異性的miRs通過調(diào)控KLF1、BCL11A和Myb等HbF相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，能激活γ珠蛋白基因，誘導(dǎo)重新表達(dá)，從而在轉(zhuǎn)錄后水平上對患者的血紅蛋白種類和含量進(jìn)行調(diào)節(jié)。因此，珠蛋白基因誘導(dǎo)的原理可能是通過減少BCL11A及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)或抑制其蛋白活性，實(shí)現(xiàn)激活γ珠蛋白表達(dá)，增加HbF含量的目的。

本研究采用補(bǔ)氣益精生血法治療β地貧，初步探討了中藥誘導(dǎo)γ珠蛋白基因表達(dá)合成HbF的分子機(jī)制。筆者采用west-ern blot方法，檢測用藥前后患兒BCL11A、KLF1、SOX6、Myb蛋白水平，結(jié)果提示中藥可顯著抑制BCL11A、SOX6、Myb蛋白水平。據(jù)此推測，中藥治療β地貧的分子機(jī)制是通過抑制紅系反式作用因子BCL11A及相關(guān)紅系轉(zhuǎn)錄因子SOX6、Myb的蛋白表達(dá)水平，激活γ-珠蛋白基因表達(dá)，從而增加HbF含量。中藥組對KLF1蛋白水平無明顯影響。KLF1與紅系分化過程密切相關(guān)，它通過結(jié)合β-珠蛋白啟動因子，促進(jìn)β-珠蛋白的表達(dá)以及γ-向β-珠蛋白基因的轉(zhuǎn)換和紅系分化。其作用機(jī)制與直接激活β珠蛋白基因、間接抑制γ珠蛋白基因表達(dá)有關(guān)［14］，而β地貧患兒由于β珠蛋白基因缺陷，對KLF1無法產(chǎn)生應(yīng)答，因此，在珠蛋白誘導(dǎo)治療中，KLF1蛋白水平無明顯變化。本次研究中，對照組對紅系反式作用因子的蛋白水平無顯著影響，還需后期加大樣本量進(jìn)行深入研究。

通過本次研究，筆者進(jìn)一步證實(shí)了補(bǔ)氣益精生血法治療β地貧，能夠顯著提高患兒Hb及HbF水平，改善貧血癥狀，達(dá)到與對照組羥基脲相近的效果，且副作用較少，對于我國南方等地貧高發(fā)區(qū)具有較大的實(shí)用價值及廣闊的應(yīng)用前景。通過檢測紅系反式作用因子的蛋白表達(dá)水平，初步探討了中藥誘導(dǎo)γ珠蛋白基因表達(dá)合成HbF的分子機(jī)制，隨著臨床應(yīng)用的開展，后續(xù)將在分子生物學(xué)機(jī)制上進(jìn)行更加深入的研究。

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