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        全自動蛋白測定系統(tǒng)在飼料粗蛋白檢測中的應(yīng)用

        2018-04-04 02:29:25袁艷茹
        鄉(xiāng)村科技 2018年1期
        關(guān)鍵詞:含氮硫酸銨全自動

        袁艷茹

        (安陽市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測檢驗(yàn)中心,河南 安陽 455000)

        蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ),是動物一切細(xì)胞、組織的重要成分,是生命活動的重要承擔(dān)者。機(jī)體所有重要的組成部分都需要有蛋白質(zhì)的參與,而且蛋白質(zhì)分解后可以給畜禽提供能量[1]。蛋白質(zhì)在維持動物的免疫功能及表達(dá)免疫活性中發(fā)揮著特殊的生物學(xué)作用[2]。此外,蛋白質(zhì)相關(guān)的血液指標(biāo)(如血紅蛋白、血清總蛋白、血清尿素氮)有所變化時,可能與畜禽的異食癖有關(guān)[3]。飼料中蛋白質(zhì)的檢測有很多種,例如,李博等[4]對飼料蛋白質(zhì)的幾種檢測方法的原理、特點(diǎn)及應(yīng)用進(jìn)行了綜合闡述,其中實(shí)驗(yàn)室比較常見是近紅外光譜技術(shù)法和凱氏定氮法。近紅外光譜分析技術(shù)具有快速的特點(diǎn),但存在靈敏度差和建模困難等缺點(diǎn)[5]。粗蛋白是飼料檢測的一個重要指標(biāo),凱氏定氮法是目前最常用的檢測粗蛋白含量的方法。凱氏定氮法原理是飼料樣品在催化劑(五水硫酸銅和硫酸鉀或硫酸鈉)作用下,用濃硫酸破壞有機(jī)物,使含氮物轉(zhuǎn)化為硫酸銨,然后加入過量強(qiáng)堿進(jìn)行蒸餾,使氮以氨氣的形式逸出,用硼酸吸收逸出的氨,之后用甲基紅溴甲酚綠為指示劑用強(qiáng)酸滴定硼酸銨,測出氮含量,將氮含量乘以蛋白轉(zhuǎn)換系數(shù)(6.25),計算出粗蛋白的含量[6]。而全自動蛋白測定系統(tǒng)則是根據(jù)經(jīng)典凱氏定氮法設(shè)計的全自動消解、全自動蒸餾、全自動滴定及出結(jié)果的半微量系統(tǒng),該系統(tǒng)為飼料中粗蛋白檢測提供了極大的便利,具有安全、準(zhǔn)確、快速、操作簡單等特點(diǎn)。全自動蛋白測定系統(tǒng)采用石墨消解儀消解樣品,然后消解液放到全自動蛋白測定儀上固定,設(shè)好參數(shù),蒸餾、定氮、滴定、出結(jié)果一氣呵成,在保證準(zhǔn)確度的前提下,整個定氮滴定出結(jié)果在10 min內(nèi)即可完成?,F(xiàn)針對全自動蛋白測定系統(tǒng)對粗蛋白的測定進(jìn)行系統(tǒng)性研究。

        1 稱取飼料樣品

        樣品稱取量應(yīng)考慮樣品的含氮量,樣品含氮量高,在盡量減少稱量誤差的前提下,應(yīng)稱取較少量的樣品;如果樣品的含氮量低,應(yīng)稱取較多的樣品。全自動蛋白測定系統(tǒng)稱取樣品含氮量15~50 mg最為合適。表1為常見飼料及原料的適宜稱樣量。

        稱樣時可用濾紙的1/4對折后稱樣,像包藥粉一樣,包裝完好,不能有樣品撒出來,之后把包好飼料包滑至消化管底部。同時做空白對照,即把1/4濾紙折好,直接滑至消化管底部。

        2 飼料樣品消化

        表1 飼料及原料適宜稱樣量

        樣品消解前,每個消化管中放入一個消解片,消解片要滑到消解管的底部。消解片是由3.6 g硫酸鉀和0.4 g五水硫酸銅混勻壓制而成的。之后每個消化管中加入10 mL濃硫酸,之后把消化管連同消化管架一同放到石墨消解儀上,打開通風(fēng)櫥和減壓排酸霧水管,蓋上排酸架蓋。消化儀上有20個孔位放置消化管,如果消化樣品不足20個,帶樣品的消化管放置可按照排煙管路的走向放置,剩下孔位,可去掉消化管塑料蓋或者放上加入10 mL濃硫酸的消化管,之后可按步驟消化。

        儀器消化參數(shù)的設(shè)置需考慮樣品是否起泡,如果樣品起泡,可設(shè)置200℃消化0.5 h,之后400℃消化2.5 h;如果樣品不起泡,直接設(shè)置400℃消化3 h。消解儀操作界面簡單,界面僅有時間和溫度參數(shù),設(shè)置好這兩個參數(shù)后,直接按確定鍵進(jìn)行消解。儀器提示消化完成后,待消化管中霧基本消失時,可以關(guān)閉減壓排酸霧水管,取出消化架,等消化液降溫后可進(jìn)行定氮蒸餾。

        消解儀是石墨消解儀,石墨消解儀具有消解快速、高效、操作方便等特點(diǎn),特別適合與凱氏定氮儀配合使用。此外,石墨消解儀爐內(nèi)溫度連續(xù)可調(diào),溫度恒定,可同時消解20個樣品,爐內(nèi)平均溫差小,樣品消解一致性好,熱傳導(dǎo)效率高。石墨經(jīng)過抗氧化處理,消解儀表面耐強(qiáng)酸強(qiáng)堿腐蝕,樣品各部受熱均勻,爐體孔間溫差小,可以快速、高效地消解樣品。

        3 飼料樣品全自動定氮、滴定

        3.1 試劑的準(zhǔn)備

        在滴定之前要準(zhǔn)備的試劑為標(biāo)定過0.1 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液,400 g/L氫氧化鈉溶液,2%硼酸溶液,0.1%甲基紅乙醇溶液,0.1%溴甲酚綠乙醇溶液,混合指示劑(甲基紅指示劑和溴甲酚綠指示劑以1∶5混合均勻)。其中,混合指示劑和2%硼酸溶液以1∶100混合均勻裝入硼酸桶;400 g/L氫氧化鈉溶液裝入堿桶;蒸餾水加入水桶,標(biāo)定過滴定酸加入滴定酸桶。

        3.2 全自動定氮、滴定過程

        先準(zhǔn)備3根空的消解管,打開全自動定氮儀開關(guān),打開冷卻水開關(guān),下面分四步進(jìn)行。第一步,進(jìn)行換算清洗。換算清洗要進(jìn)行三四次,這個過程可以排掉滴定酸管路的氣泡,相當(dāng)于潤洗滴定酸管路。第二步,把第一個空的消解管放到定氮儀上固定,之后按儀器上測試鍵,輸入相應(yīng)滴定酸濃度,硼酸體積15 mL,稀釋水10 mL,堿5 mL,蒸餾5 min,設(shè)置好后按確定鍵,全自動定氮滴定開始。第一管也被稱為空蒸,以使各個管路充滿液體,也是對蒸餾管路進(jìn)行預(yù)熱。接著第二三個空管按上面參數(shù)進(jìn)行定氮滴定,所用滴定酸體積應(yīng)小于0.05 mL,主要是看換算清洗是否徹底。此外,第二三個管各自所用滴定酸體積一般小于0.1 mL,這主要體現(xiàn)定氮滴定系統(tǒng)空體積。第三步,準(zhǔn)備2個稱取0.1 g左右干燥過的基準(zhǔn)硫酸銨于消化管,樣品質(zhì)量輸入實(shí)際稱取硫酸銨的質(zhì)量,空體積為第二步第二個管和第三個管所用滴定酸體積的平均值,堿體積改為10 mL,其他參數(shù)和第二步一樣,按確定鍵開始定氮滴定,2個硫酸銨管都進(jìn)行完后,查看含氮量是否為21.19%±0.2%。如果是,可以做樣品;如果不是,可以檢查儀器的各個管路,如果儀器管路沒有問題,硫酸銨含氮量比較穩(wěn)定,可以考慮做定標(biāo)系數(shù)來校準(zhǔn)儀器的系統(tǒng)誤差。第四步,做樣品。樣品質(zhì)量按實(shí)際稱取量填寫,空白樣品質(zhì)量不需填寫,堿參數(shù)改為50 mL,蛋白系數(shù)為6.25,其他參數(shù)同第一步。先做2個空白樣品,做完后2個管所用酸的體積的平均值作為樣品的空白體積。然后填入?yún)?shù),即可做樣品。做完樣品后滴定酸體積、粗蛋白含量、氮含量便可顯示出來,如果需要打印直接按打印鍵。測定結(jié)果2個平行樣之間的精密度用相對偏差進(jìn)行記錄,偏差要求為CB/T 6432—94的組蛋白偏差要求。

        儀器設(shè)置好各個參數(shù),按確定鍵儀器開始自動進(jìn)行所有步驟。試驗(yàn)步驟為加稀釋水、加硼酸、加堿、蒸餾、滴定、計算、打印和接受杯清洗(主要在于設(shè)置參數(shù)里是否選定該項(xiàng),選定則有這個步驟)。在測試過程中全自動定氮滴定系統(tǒng)實(shí)時采集儀器多方面狀態(tài)信息:蒸汽發(fā)生器的水位,安全門在位,冷凝水有無等。如果有異常,儀器會暫停任務(wù)。全自動系統(tǒng)實(shí)時顯示當(dāng)前操作項(xiàng)目及實(shí)時量,當(dāng)前功能完成后自動轉(zhuǎn)移至下一試驗(yàn)功能。此外,試驗(yàn)過程中隨時可以暫停試驗(yàn)。試驗(yàn)過程中如果某個參數(shù)為0,試驗(yàn)過程不開啟此項(xiàng)功能。

        3.3 定標(biāo)系數(shù)K

        儀器測定樣品時,由于各系統(tǒng)連接會有系統(tǒng)誤差,為了測定結(jié)果的精確,建立偏差校正系數(shù)K。

        校準(zhǔn)時可選用干燥基準(zhǔn)硫酸銨,直接精密稱取0.1 g左右硫酸銨于消解管中,固定在全自動定氮儀消化管位置,參數(shù)同3.2中硫酸銨測定參數(shù)相同,直接讀取結(jié)果中的含氮量。

        K值的計算為K=N/N1。其中,N1為標(biāo)準(zhǔn)樣品中氮的百分含量,一般為硫酸銨理論氮的百分含量乘以其純度;N為儀器測出的標(biāo)準(zhǔn)樣品中氮的百分含量。

        一般準(zhǔn)備硫酸銨固定樣品3份,上機(jī)測定,得到3個氮的百分含量,同時得到3個K的值,3個K值平均值就是定標(biāo)系數(shù)K。把定標(biāo)系數(shù)填到儀器設(shè)置下定標(biāo)系數(shù),再測幾個硫酸銨固體樣品,使得含氮量在21.19%±0.2%。

        4 結(jié)語

        全自動蛋白測定系統(tǒng)具有準(zhǔn)確、快速、安全、操作簡便的特點(diǎn),本文對全自動蛋白測定系統(tǒng)測定飼料中粗蛋白的方法進(jìn)行了探究,希望有助于該系統(tǒng)得到廣泛應(yīng)用。

        [1]蛋白質(zhì)飼料對畜禽的營養(yǎng)作用[J].甘肅畜牧獸醫(yī),2017(2):104.

        [2]董佳綺,金三俊,汪晶晶,等.蛋白質(zhì)營養(yǎng)水平對畜禽免疫作用的影響[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2017(9):80-82.

        [3]李志靜,周玉香.日糧蛋白質(zhì)對畜禽異食癖以及消化代謝和生理功能的影響[J].飼料研究,2013(11):40-43.

        [4]李博,楊衛(wèi)軍,張珍珍.飼料中蛋白質(zhì)檢測方法的研究進(jìn)展[J].畜牧與飼料科學(xué),2017(6):38-40.

        [5]趙雅新,王紅英.近紅外光譜技術(shù)在飼料工業(yè)中的應(yīng)用進(jìn)展[J].飼料工業(yè),2005(21):37-41.

        [6]國家技術(shù)監(jiān)督局.飼料中粗蛋白測定方法:GB/T 6432—94[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,1994.

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