周　黎，余以剛，徐　紅，黃焯枝，郭文婷，郭偉鵬

(1華南理工大學(xué)，廣州　510006；2達(dá)能(中國)食品飲料有限公司，廣州　510000；3省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州　510070；4廣東省微生物研究所，廣州　510070；5廣東省微生物分析檢測(cè)中心，廣州　510070)

我國對(duì)維生素B12的允許添加量有明確的規(guī)定[1-2]，其中飲料類產(chǎn)品的允許添加量為0.6～1.8μg/kg。目前檢測(cè)維生素B12的方法主要有微生物法[3]、原子吸收法[4]、高效液相色譜法[5]等。其中，微生物法具有工作效率低、操作復(fù)雜、成本較高的缺點(diǎn)；原子吸收法由于受基質(zhì)影響，檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確，特別是分析含量低的樣品；高效液相色譜法具有操作簡單、分析準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，但是對(duì)于成分復(fù)雜、維生素含量低的樣品難以進(jìn)行定量或者定性分析，因此本檢測(cè)方法采取對(duì)高效液相色譜法進(jìn)行改進(jìn)，將超高效液相色譜法結(jié)合免疫親和柱對(duì)樣品進(jìn)行分析，免疫親和柱對(duì)維生素B12具有較高的選擇性，可以對(duì)樣品維生素B12進(jìn)行純化和富集，再經(jīng)超高效液相色譜法檢測(cè)樣品從而達(dá)到分析準(zhǔn)確、快速、成本低、操作簡單的目的。因此，將免疫親和柱—超高效液相色譜法運(yùn)用到成分復(fù)雜的飲料中低含量維生素B12的測(cè)定具有重大的意義。

1　試驗(yàn)與材料

1.1　儀器與試劑

超高效液相色譜儀(美國Waters公司)；超聲波清洗儀，美國Auto science公司；氮吹儀，中國安譜公司；固相萃取儀，美國CNW公司；超純水機(jī)，美國Millipore公司；維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品，99.9%，美國supelco公司；免疫親和柱，德國拜發(fā)公司；甲酸、乙腈、甲醇、三氟乙酸，色譜純，美國CNW公司；乙醇，分析純，廣州化學(xué)試劑廠。

1.2　色譜條件

色譜柱HSS T3(2.1mm*75mm，1.8μm，流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸梯度洗脫，柱溫35℃，進(jìn)樣量50μL，流速0.6 mL/min，檢測(cè)波長360nm，洗脫溶劑A相為乙腈，B相為0.1%甲酸，梯度洗脫參數(shù)如表1所示。

表1　流動(dòng)相梯度時(shí)間、流速與比例參數(shù)

1.3　樣品前處理

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制維生素B12的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品12.0mg溶于5%的乙醇溶液中，用50mL棕色容量瓶定容，混勻后備用。取1mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用水稀釋至250mL棕色容量瓶中，得到維生素B12的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，再分別取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL標(biāo)準(zhǔn)中間溶液用水稀釋至1 000mL棕色容量瓶中，得到維生素B12的標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2免疫親和柱純化和富集取25mL維生素飲料進(jìn)樣到真空處理除去緩沖液的免疫親和柱上，用10mL超純水淋洗后，真空抽干殘留液使親和柱干燥，再用3mL甲醇溶液反沖洗3次(1次反沖洗用1mL甲醇，共3次)。洗脫時(shí)控制為1滴/秒的流速滴到試管中，于60～70℃下用氮?dú)獯蹈上疵撘?，再?.3mL 0.025%三氟乙酸溶液溶解后得到的溶液用于上機(jī)分析。

2　結(jié)果與討論

2.1　前處理凈化柱的選擇

維生素飲料經(jīng)免疫親和柱和Watres Sep-Pak C18(500mg/6cc)柱純化后得到的圖譜如圖1和圖2所示。經(jīng)免疫親和柱過濾后的圖譜相比WatresSep-Pak C18(500mg/6cc)柱過濾后的圖譜顯示出更好的分離效果，基線平穩(wěn)且維生素B12出峰無干攏，雜質(zhì)少。因此，為了對(duì)維生素飲料中B12進(jìn)行定性與定量的分析，選擇免疫親和柱過濾純化后得到的樣品進(jìn)行后續(xù)測(cè)定。

圖1　維生素飲料經(jīng)免疫親和柱過濾后的色譜圖

圖2　　　　維生素飲料經(jīng)Watres Sep-Pak C18(500mg/6cc)柱過濾后的色譜圖

2.2　洗脫過程中甲醇量的選擇

采用4種洗脫方法進(jìn)行比較確定洗脫過程中最佳的甲醇量：(1)3mL甲醇洗脫1次；(2)1mL甲醇洗脫1次；(3)分別取3次1mL甲醇洗脫3次；(4)分別取3次1mL甲醇反復(fù)來回抽到針筒洗脫3次樣品。以上4種洗脫方法速度均為1滴/秒，結(jié)果表明，4種洗脫方法的回收率分別為82.1%、65.2%、88.2%、94.3%，故選擇第4種方法比較理想。

2.3　洗脫過程中pH的選擇

如圖3所示，pH7.0條件下經(jīng)免疫親和柱富集純化后樣品的維生素B12的含量為0.16μg/100mL左右，而pH3.0條件下經(jīng)免疫親和柱富集純化后樣品的維生素B12的含量為0.12μg/100mL左右。結(jié)果表明，pH7.0條件下更有利于免疫親和柱對(duì)維生素B12的富集和洗脫，因此選擇調(diào)整維生素飲料的pH為7.0時(shí)進(jìn)行免疫親和柱富集和洗脫。

圖3　　　　維生素飲料在pH 3.0和pH 7.0條件下經(jīng)免疫親和柱洗脫后維生素B12含量的變化情況

2.4　樣品的保存與分析

將同一批次生產(chǎn)的維生素飲料分別于20℃、45℃和日光燈條件下存放1個(gè)星期，所測(cè)得的維生素B12含量結(jié)果見表2。不同條件下放置的樣品維生素B12的含量依次為20℃>45℃>日光燈，表明光照以及高溫會(huì)加速維生素B12的分解，因此含有維生素B12的維生素飲料更適合在20℃室溫與避光條件下存放。

表2維生素飲料的維生素B12含量單位：μg/L

條件20℃45℃日光燈含量145125113

2.5　線性關(guān)系及回收率實(shí)驗(yàn)

在濃度為0.4～10μg/L內(nèi)測(cè)定維生素B12的標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得的線性回歸方程為Y=4 040X-364，相關(guān)系數(shù)為0.997 00，顯示出較好的線性關(guān)系。同時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行含量分析，在已知濃度的樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)測(cè)定4次，加入值為30.1μg/L時(shí)，測(cè)定值為28.5μg/L，所得回收率為94.68%，檢出限為0.1μg/L，顯示出較高的準(zhǔn)確性。表明運(yùn)用免疫親和柱—超高效液相色譜法測(cè)定維生素飲料中低濃度維生素B12的含量是非常準(zhǔn)確可靠的。

2.6　系統(tǒng)精密度試驗(yàn)

同一瓶維生素飲料，在1d內(nèi)連續(xù)測(cè)定6次，其精密度數(shù)據(jù)如表3所示，維生素B12的峰面積的RSD為0.65%，精密度良好。說明免疫親和柱—超高效液相色譜法測(cè)定維生素飲料中低濃度維生素B12的含量具有較高的精密度，因此該方法應(yīng)用到維生素飲料中低濃度維生素B12的含量測(cè)定是切實(shí)可行的。

表3　樣品精密度

3　結(jié)論

針對(duì)維生素飲料中成分復(fù)雜、維生素B12含量很低的特點(diǎn)，直接采用超高效液相色譜法測(cè)定維生素B12很難對(duì)其進(jìn)行定性或定量的分析，因此本研究建立了免疫親和柱—超高效液相色譜法測(cè)定維生素飲料中B12的方法。由于免疫親和柱對(duì)維生素B12具有很高的選擇性，可以有效的去除雜質(zhì)的干擾，對(duì)維生素B12進(jìn)行純化。同時(shí)根據(jù)儀器與色譜柱的特性，采用乙腈-0.1%甲酸溶液梯度洗脫樣品，具有較好分離效果，基線穩(wěn)定。結(jié)果表明，采用免疫親和柱—超高效液相色譜法測(cè)定維生素飲料中維生素B12具有較高的回收率為94.68%，且檢出限低至0.1μg/mL。因此該檢測(cè)方法非常適用于成分復(fù)雜、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、維生素含量低的飲料中維生素B12的測(cè)定，相比傳統(tǒng)的高效液相色譜法具有工作效率高、分析時(shí)間短且更準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。◇

[1]吳楠，姜金斗，等.免疫親和柱凈化/高效液相色譜法測(cè)定乳粉中B12的含量[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2013，32(3)：389-392.

[2]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 2760-2011 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2011.

[3]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 5413.14-2010 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒食品和乳品中維生素B12的測(cè)定[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

[4]李妹.紫外吸光光度法測(cè)定維生素B12[J].理化檢驗(yàn)(化學(xué)分冊(cè))，2005，41(1)：53-54.

[5]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB/T5009.217-2008保健食品中維生素B12的測(cè)定[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

[6]姜學(xué)群.高效液相色譜法測(cè)定維生素B12片的含量[J].咸寧學(xué)院學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2010，24(1)：70-72.

[7]高旭.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定食品中8種水溶性維生素[J].中國醫(yī)藥指南，2008，6(19)：36-39.