馬 佳 郝紹文 趙新艷 戴曉婧 焦海燕，3△

(寧夏醫(yī)科大學(xué)， 1 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 2 總醫(yī)院急診科， 3 教育部生育力保持省部共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 銀川 750004；4 銀川市公安局， 銀川 750004； 5 美國(guó)得克薩斯大學(xué)健康科學(xué)研究所， 德克薩斯州 77030， 美國(guó))

短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeats，STR)是一類具有長(zhǎng)度多態(tài)性的DNA序列，廣泛存在于真核生物基因組非編碼區(qū)，不轉(zhuǎn)錄和編碼蛋白質(zhì)。STR核心序列為2～7 bp, 其基因座所在的染色體區(qū)域包含多達(dá)幾十萬(wàn)kb的DNA序列，并和染色體上的“熱點(diǎn)區(qū)域”結(jié)合而表現(xiàn)出高度的連鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD), 且遵循孟德爾遺傳定律。目前，STR已被廣泛用于法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別、親權(quán)鑒定、疾病相關(guān)基因的定位等眾多領(lǐng)域。STR不受選擇壓力的影響，其突變可在進(jìn)化過(guò)程中穩(wěn)定傳遞、積累，能保守的在不同群體間傳遞或僅出現(xiàn)在某些特定群體中[1]，不同地區(qū)人群STR位點(diǎn)的基因座等位基因頻率分布存在差異，形成高度多態(tài)性[2]。因此，獲取不同地區(qū)群體STR遺傳特征是非常必要的。本研究以寧夏地區(qū)漢族人群為研究對(duì)象，分析19個(gè)STR在寧夏地區(qū)漢族群體的遺傳多態(tài)性。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

隨機(jī)選擇寧夏籍漢族且無(wú)血緣關(guān)系個(gè)體347名，其中，女性139例，年齡19～51歲，平均年齡(26.9±6.4)歲；男性208例，年齡22～55歲，平均(24.0±9.3)歲。所有受試者均對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書；本研究經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。采集其外周血，制成FTA(Flinders Technology Associates，F(xiàn)TA)卡，常溫保存。

1.2 DNA提取及擴(kuò)增

取孔徑為1.0 mm的圓片血樣，使用GoldeneyeTM20A 復(fù)合STR檢測(cè)系統(tǒng)， 按照Goldeneye 20A試劑盒說(shuō)明書(北京基點(diǎn)認(rèn)知公司)，應(yīng)用ABI 9700型擴(kuò)增儀(ABI公司)，對(duì)19個(gè)STR基因座(D19S433、D5S818、D21S11、D18S51、D6S1043、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、Penta D、vWA、D8S1179、TPOX、Penta E、 TH01、D12S391、D2S1338、FGA) 及牙釉基因直接進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為10 μl，其中，PCR Reaction Mix: 4.0 μl；Primer set: 2.0 μl；Taq Gold@ DNA聚合酶：0.16 μl；無(wú)菌去離子水：3.84 μl。擴(kuò)增條件為：95℃×5 min；(94℃×30 s，60℃×60 s，70℃×60 s)×28循環(huán)；60℃×35 min；擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳及檢測(cè)

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)甲酰胺變性后，在ABI 3500 XL 型遺傳分析儀上進(jìn)行電泳。在樣本檢測(cè)過(guò)程中，以DNA 9947A作為陽(yáng)性對(duì)照，去離子水作為陰性對(duì)照。使用Gene Mapper ID V3.2軟件進(jìn)行基因分型。等位基因命名根據(jù)國(guó)際法醫(yī)遺傳學(xué)會(huì)(International Society for Forensic Geneics，ISFG)等位基因命名原則和 Ladder為參照進(jìn)行樣本等位基因分型。采用 Data Collection 2. 0 軟件將收集的電泳圖譜信息處理成數(shù)據(jù)信息，使用 Gene Mapper ID software V3.2軟件[3]進(jìn)行等位基因分型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用 HWE精確檢驗(yàn)軟件進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，采用powerstate V1.2[4]軟件分別計(jì)算19個(gè)STR基因座的等位基因頻率、基因型頻率、期望雜合度(expected heterozyogosity，He)、匹配概率(probability match, Pm)、個(gè)體鑒別力(power of discrimination，DP)、非父排除率(power of exclusion，PE)、多態(tài)性信息含量(polymorphism information content，PIC)等群體遺傳學(xué)指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 19個(gè)STR基因座PCR擴(kuò)增和測(cè)序

347例樣本檢出率為100%，19個(gè)STR基因座位點(diǎn)均得到了有效的擴(kuò)增，測(cè)序圖譜顯示擴(kuò)增結(jié)果較好，特異性較高。對(duì)照STR(9947a)、ladder與樣本進(jìn)行了同步檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與說(shuō)明書完全相符，說(shuō)明檢測(cè)結(jié)果真實(shí)可靠。STR檢測(cè)結(jié)果舉例說(shuō)明見圖1。

2.2 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

采用HWE精確檢驗(yàn)軟件對(duì)寧夏漢族人群的19個(gè)STR基因座位點(diǎn)的基因型頻率分布進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。結(jié)果顯示，各基因座基因型頻率分布通過(guò)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)(P>0.05)，顯示研究對(duì)象具有很好的群體代表性(表1)。

表1 寧夏地區(qū)漢族人群19個(gè)STR基因座的P值(n=347)Tab 1 P values of 19 STR loci in Ningxia Han population(n=347)

圖1 STR基因座測(cè)序圖Fig 1 STR analysis of sample DNA

2.3 寧夏地區(qū)漢族人群19個(gè)STR基因座等位基因頻率分布

在受檢的347例寧夏漢族無(wú)關(guān)個(gè)體的19個(gè)STR基因座上共檢出120個(gè)等位基因、775種基因型，等位基因頻率分布范圍在0.001至0.503?；蛐皖l率從高到低的順序排列為：D12S391、D18S51、D6S1043、D21S11、D2S1338、FGA、Penta D、D3S1358、D5S818、D13S317、D7S820、D19S433、CSF1PO、D16S539、TH01、vWA、TPOX。D8S1179、Penta E(表2)。

表2 寧夏地區(qū)漢族人群19個(gè)STR基因座等位基因頻率分布(n=347)Tab 2 The allele frequencies of 19 STR loci in Ningxia Han population(n=347)

(續(xù)表2)

2.4 寧夏地區(qū)漢族人群的19個(gè)STR基因座的法醫(yī)參數(shù)

應(yīng)用Powerstats軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，寧夏地區(qū)漢族人群19個(gè)STR基因座的Pm在0.032～0.186 之間，DP在0.814～0.986之間， PE在0.330 ～0.770之間，親權(quán)指數(shù)(paternity index，PI)在1.360～5.260 之間，PIC在0.590～0.920之間，He在0.631～0.905 之間。這19個(gè)STR基因座之間無(wú)連鎖遺傳關(guān)系。提示這19個(gè)STR對(duì)寧夏地區(qū)漢族在法醫(yī)學(xué)中的親子鑒定和個(gè)人識(shí)別具有較高應(yīng)用價(jià)值(表3)。

表3 寧夏地區(qū)漢族人群19個(gè)STR基因座的法醫(yī)參數(shù)(n=347)Tab 3 Forensic parameters of 19 STR loci in Ningxia Han population(n=347)

He：Expected heterozyogosity；PE：Power of exclusion；Pm：Probability match；DP：Power of discrimination；PIC：Polymorphism information content；PI：Paternity index

3 討論

本研究采用 GoldeneyeTM20A 試劑盒對(duì)寧夏漢族群體19個(gè)STR基因座遺傳多態(tài)性進(jìn)行了分析。GoldeneyeTM20A復(fù)合STR檢測(cè)系統(tǒng)由19個(gè)STR基因座和1個(gè)判定性別的牙釉基因構(gòu)成，包含了中國(guó)國(guó)家DNA數(shù)據(jù)庫(kù)(National DNA database，NDNAD)所選用的這些試劑盒中的全部STR基因座，在數(shù)據(jù)庫(kù)信息檢索時(shí)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)同一樣本數(shù)據(jù)中更多STR分型信息的比對(duì)，提高了數(shù)據(jù)庫(kù)檢索的兼容性和準(zhǔn)確性。同時(shí)，使用更多的STR基因座，也意味著更高的多態(tài)性和法醫(yī)學(xué)鑒別能力[5]。

目前，國(guó)內(nèi)已有對(duì)不同地區(qū)、不同民族人群STR基因座基因頻率的相關(guān)研究分析的報(bào)道，這些研究結(jié)果顯示，在不同地區(qū)人群間相同STR基因座等位基因頻率分布存在一定差異。如胡利平等[6]報(bào)道20個(gè)STR基因座(較本研究多了D1S656)在國(guó)內(nèi)不同人群的分布存在差異。陳雁等[7]對(duì)比了所檢測(cè)的相同STR基因座(D19S433、D5S818、 D21S11、 D18S51、 D6S1043、 D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、Penta D、vWA、D8S1179、TPOX、Penta E、TH01、D12S391、D2S1338、FGA)的等位基因頻率，結(jié)果顯示浙江漢族人群與廣東地區(qū)漢族人群[8]、新加坡華人[9]、東北地區(qū)漢族人群[10]之間的上述等位基因頻率的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；浙江人群與華東地區(qū)漢族人群[11]之間除TPOX外其余基因座差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。還有研究顯示浙江漢族人群和華南地區(qū)在STR D18S51、PentaE、D5S818、D16S539、PentaD、TPOX、FGA這7個(gè)基因座的基因頻率分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[12]；云南漢族人群[13]15個(gè)STR本研究中除了D6S1043、Penta D、Penta E、D12S391)基因座與廣州[14]、臺(tái)灣[15]、河南[16]、濟(jì)南[17]、新疆[18]、遼寧[19]地區(qū)漢族人群相比，D21S11、vWA、TPOX、FGA、D5S818的等位基因頻率分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所以，獲取不同地區(qū)和民族STR位點(diǎn)基因座等位基因頻率是非常必要的。

本研究結(jié)果顯示寧夏漢族人群19個(gè)STR基因座上共檢出120個(gè)等位基因、775種基因型，等位基因頻率分布范圍在0.001至0.503。基因型頻率最高的是D12S391，最低的是Penta E。通過(guò)對(duì)寧夏地區(qū)漢族與屈曉斌等[20]研究的江蘇漢族人18個(gè)STR基因座CSF1PO、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D19S433、D21S11、FGA、TH01、TPOX、vWA、D2S1338、D6S1043、Penta D、Penta E、D12S391等位基因頻率的分布差異進(jìn)行比較，結(jié)果顯示TH01(P=0.002)、D3S1358(P=0.021)、D21S11(P=0.015)、Panta D(P=0.01)、D7S820(P=0.029)的等位基因頻率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

一般認(rèn)為，PIC>0.5時(shí)，說(shuō)明該標(biāo)記可提供較高的信息量。結(jié)果顯示(表2)寧夏漢族人群的PIC在0.590～0.920之間。DP和PE 則反映了該遺傳標(biāo)記在法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別及親權(quán)鑒定中的能力。通常情況下，當(dāng)DP>0.8、He>0.7、PIC>0.7、PE>0.5時(shí)，說(shuō)明標(biāo)記物是高度多態(tài)性的遺傳標(biāo)記，具有極高的應(yīng)用價(jià)值[21-22]。寧夏漢族人群的DP在 0.814～0.986之間，He在 0.631～0.905之間，PE 在0.330 ～0.770之間，除TH01、TPOX、D3S1358外，其余位點(diǎn)均顯示出高度鑒別力、高雜合度，可聯(lián)合應(yīng)用于親權(quán)鑒定。因此，本研究所選取的19個(gè)STR基因座屬于寧夏漢族人群中高鑒別能力、高雜合度、高信息量的STR的基因座。