李盈潔 鄭 莉 張華陽(yáng) 黃守娟 易學(xué)良 胡 析 牛英杰 任艷茹 杜子君 張 曉 梁 楠

(成都醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心， 成都 610500)

脊髓鈍挫傷[1](spinal cord contusion，SCC)是一種嚴(yán)重中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，可導(dǎo)致?lián)p傷節(jié)段以下肢體的運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)功能障礙[1-2]。脊髓損傷導(dǎo)致單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1)等趨化性細(xì)胞因子激活，使有關(guān)的炎性細(xì)胞侵入受損脊髓產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，造成繼發(fā)性脊髓損傷[3-4]。繼發(fā)性脊髓損傷又會(huì)引起病灶周?chē)恼＝M織發(fā)生破壞性病變，包括脊髓的組織水腫、細(xì)胞凋亡和壞死等[5-6]，進(jìn)一步加重神經(jīng)功能損害。MCP-1是趨化細(xì)胞因子家族[2]的代表，可趨化單核細(xì)胞向組織遷移[7-8]，也能激活單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，參與脊髓損傷部位的繼發(fā)性炎癥反應(yīng)[4， 9]。MCP-1能夠識(shí)別多個(gè)受體，趨化因子受體2(chemokine receptor 2，CCR2)是MCP-1的首選受體[10]。

本項(xiàng)目制備大鼠SCC模型，評(píng)價(jià)大鼠的運(yùn)動(dòng)功能和溫痛覺(jué)功能，采用熒光定量PCR檢測(cè)脊髓損傷節(jié)段中CCR2 mRNA和MCP-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量，采用免疫組織化學(xué)法對(duì)MCP-1和CCR2在脊髓損傷節(jié)段的前角和后角的表達(dá)進(jìn)行定位研究，從而了解大鼠SCC后MCP-1和CCR2的表達(dá)情況，探討大鼠脊髓損傷后MCP-1與CCR2對(duì)運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)功能的作用，從而為今后臨床治療SCC的提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物分組

健康成年SD大鼠50只，雌性，體質(zhì)量為200～220 g(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)，隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham組)和脊髓鈍挫損傷(SCC組)術(shù)后12 h、3 d、7 d、14 d組，每組10只動(dòng)物。每組6只動(dòng)物用于PCR實(shí)驗(yàn)，4只動(dòng)物用于免疫組織化學(xué)顯色，觀察MCP-1和CCR2在大鼠脊髓前角和后角的定位。

1.2 脊髓鈍挫傷模型制備

大鼠稱(chēng)重后用3.6%水合氯醛(10 ml/kg)腹腔注射麻醉，備皮，常規(guī)消毒。以神經(jīng)節(jié)段第10胸椎(T10)為中心，縱行切開(kāi)皮膚及皮下組織，分離椎旁肌并暴露棘突與椎板，咬除椎板， Allen法制備模型，10 g沖擊棒自30 mm高處自由墜落打擊脊髓節(jié)段，然后按照肌、筋膜、皮膚的順序依次縫合傷口。術(shù)后腹腔注射青霉素，早晚協(xié)助大鼠排尿，直至大鼠恢復(fù)反射性排尿。在此期間注意觀察皮膚有無(wú)壓瘡或感染、下肢有無(wú)潰爛。假手術(shù)組的大鼠僅剝除相應(yīng)椎板，不打擊脊髓節(jié)段，其余操作均與SCC組一致。所有動(dòng)物飼養(yǎng)室溫維持在25℃～30℃，正常飲食飼養(yǎng)。

1.3 大鼠后肢Basso Beattie Bresnahan(BBB)運(yùn)動(dòng)評(píng)分

參照Basso、Beattie、Bresnahan等[11]提出的大鼠SCI后功能評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)(BBB評(píng)分法)，對(duì)各實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的后肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)分。為盡量避免評(píng)分的主觀性，分別由掌握評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)的3人進(jìn)行盲評(píng)，取其平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.4 溫痛覺(jué)評(píng)分

SCC 后3、7、14 d組動(dòng)物進(jìn)行溫痛覺(jué)測(cè)試。打開(kāi)光熱尾痛儀(成都泰盟軟件有限公司)電源，預(yù)熱5 min。將大鼠用固定器固定好，暴露出尾部，將大鼠尾端后 1/3 處置于熱光源聚光點(diǎn)處，記錄大鼠甩尾時(shí)間。每只大鼠測(cè)試3次后取平均值作為甩尾時(shí)間，每次測(cè)量間隔5 min。

1.5 熒光定量PCR

大鼠麻醉，灌注生理鹽水，以脊髓損傷節(jié)段為中心取0.5 cm脊髓，放入無(wú)RNA酶的EP管(愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司)中。加入1 ml TRIzol(上海拜力生物科技有限公司)勻漿破碎組織細(xì)胞，提取總RNA。采用試劑盒HiscriptR Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)R123-01(諾唯贊生物科技有限公司)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，存于-20℃。設(shè)計(jì)大鼠內(nèi)參β-actin、CCR2 和MCP-1的上下游引物序列和探針序列(表1)。反應(yīng)條件如下：(1)β-actin：95℃ 3 min；95℃ 10 s，53℃ 30 s，60℃ 30 s，45 cycles；(2)CCR2：95℃ 3 min；95℃ 10 s，44℃ 30 s，60℃ 30 s，45 cycles；(3)MCP-1：95℃ 3 min；95℃ 10 s，56℃ 30 s，60℃ 30 s，45 cycles。讀取CT值，采用公式R=2-ΔΔCt計(jì)算各標(biāo)本的待測(cè)基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 MCP-1與CCR2的引物序列與探針序列信息Tab 1 Primer sequence and taq man probe of MCP-1 and CCR2

1.6 免疫組織化學(xué)顯色

大鼠麻醉，多聚甲醛灌注，以脊髓損傷節(jié)段為中心取0.5 cm脊髓，進(jìn)行脫水、包埋、制備成5 μm的石蠟切片。采用SP法進(jìn)行免疫組織化學(xué)顯色，即：石蠟切片烤片2 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，抗原修復(fù)后自然冷卻；用3% H2O2(北京中杉金橋公司)37℃預(yù)處理15 min；PBS漂洗3次，每次5 min；用5% 山羊血清(北京中杉金橋公司)，37℃ 20 min；滴加一抗，分別為CCR2(Rb，博士德生物，1∶200)，MCP-1(Rb，北京博奧森生物技術(shù)有限公司，1∶50)，4℃過(guò)夜，次日用PV-9000試劑(北京中杉金橋公司)B液和C液分別在37℃中孵育15 min，DAB顯色、蘇木精復(fù)染、鹽酸酒精分色，脫水、透明、封片。熒光倒置顯微鏡(北京恒三江儀器銷(xiāo)售有限公司)下(×400)觀察免疫陽(yáng)性反應(yīng)物表達(dá)分布情況，拍照，采集圖片。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)采用表示，用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，用Levene方法進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠脊髓損傷后BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分與溫痛覺(jué)感覺(jué)功能測(cè)定

BBB評(píng)分結(jié)果顯示，SCC后BBB運(yùn)功功能評(píng)分在12 h、3 d、7 d、14 d均低于假手術(shù)組(P<0.05)，且隨著時(shí)間的推移未能恢復(fù)到正常水平。SCC組的BBB評(píng)分結(jié)果顯示，7 d與14 d BBB評(píng)分較12 h與3 d組增高(P<0.05)，14 d組評(píng)分結(jié)果較7 d組增高(P<0.05)，即大鼠脊髓損傷后，后肢BBB評(píng)分在損傷后12 h、3 d 降低，然后隨時(shí)間延長(zhǎng)評(píng)分開(kāi)始逐漸升高，14 d 時(shí)達(dá)到最大值，但未恢復(fù)至正常水平(圖1)。

大鼠脊髓損傷后溫痛覺(jué)測(cè)試結(jié)果顯示(圖2)，與假手術(shù)組相比，3 d、7 d溫痛覺(jué)潛伏期縮短且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，14 d溫痛覺(jué)潛伏期與假手術(shù)組比較變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 大鼠SCC后BBB評(píng)分結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖Fig 1 BBB score after SCC in rats

圖2 大鼠SCC后溫痛覺(jué)潛伏期測(cè)定結(jié)果Fig 2 The latency of warm pain after SCC in rats

2.2 大鼠脊髓損傷節(jié)段中 CCR2和MCP-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量

用管家基因β-actin作為內(nèi)參，定量PCR顯示CCR2在脊髓損傷后的表達(dá)變化。假手術(shù)組CCR2 mRNA表達(dá)量較低，與假手術(shù)組相比，SCC后12 h 和 3 d 組CCR2 mRNA表達(dá)量明顯增高(P<0.05)；與 12 h 與3 d相比，SCC后 7 d與14 d CCR2 mRNA降低(P<0.05)。結(jié)果顯示大鼠脊髓鈍挫傷后，CCR2 mRNA的表達(dá)量先增加，在SCC后12 h達(dá)到最大值，然后隨著時(shí)間的推移逐漸下降(表2)。

用管家基因β-actin作為內(nèi)參，定量PCR顯示MCP-1在脊髓損傷后的表達(dá)變化。假手術(shù)組MCP-1 mRNA表達(dá)量很低，與假手術(shù)組相比，SCC后12 h、3 d、7 d組 MCP-1 mRNA表達(dá)量明顯增高(P<0.05)。與12 h相比，SCC后3 d、7 d、14 d組 MCP-1 mRNA顯著下降(P<0.05)。結(jié)果顯示大鼠SCC后，MCP-1 mRNA的表達(dá)量先增加，在SCC后12 h達(dá)到最大值，然后隨著時(shí)間的推移逐漸下降(表2)。

表2 SCC后MCP-1與CCR2 mRNA表達(dá)水平Tab 2 The mRNA expression level of MCP-1 and

2.3 MCP-1和CCR2在大鼠脊髓前角和后角的表達(dá)及定位

免疫組織化學(xué)顯色結(jié)果顯示(圖3)，在脊髓前角中，MCP-1和CCR2陽(yáng)性產(chǎn)物主要表達(dá)在神經(jīng)元中(圖3紅色箭頭所示)。在脊髓后角中，MCP-1和CCR2陽(yáng)性產(chǎn)物要表達(dá)在神經(jīng)元(圖3藍(lán)色箭頭所示)和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中(圖3黑色箭頭所示)。

3 討論

脊髓損傷后，早期炎癥反應(yīng)引起的脊髓繼發(fā)性損傷會(huì)進(jìn)一步加重神經(jīng)功能損害，嚴(yán)重影響了運(yùn)動(dòng)功能和感覺(jué)功能障礙的恢復(fù)，因此，研究繼發(fā)性損傷相關(guān)因子MCP-1和CCR2對(duì)于脊髓損傷的修復(fù)具有十分重要的意義。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究SCC后MCP-1和CCR2在脊髓損傷部位的表達(dá)及定位情況，觀察大鼠SCC后運(yùn)動(dòng)功能和感覺(jué)功能的變化，從而探索MCP-1和CCR2對(duì)SCC后脊髓功能恢復(fù)的影響。

MCP-1是炎癥反應(yīng)的始動(dòng)因子，MCP-1的啟動(dòng)因子上有核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor- κB，NF-κB)的結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò)與NF-κB上的DNA結(jié)合可激活MCP-1基因轉(zhuǎn)錄。MCP-1主要與細(xì)胞膜上的特異性受體CCR2相結(jié)合，CCR2是G蛋白偶聯(lián)受體，MCP-1與CCR2通過(guò)趨化因子→受體→G蛋白→酶→第二信使→蛋白激酶→功能蛋白/酶→生物學(xué)效應(yīng)的信息傳遞途徑趨化單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞到達(dá)免疫應(yīng)答部位、或者誘導(dǎo)調(diào)節(jié)其他炎性介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放，介導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)[9]。

3.1 MCP-1和CCR2對(duì)SCC后脊髓運(yùn)動(dòng)功能的影響

大鼠脊髓損傷后BBB評(píng)分結(jié)果顯示，脊髓損傷早期12 h和3 d評(píng)分嚴(yán)重下降，提示脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能?chē)?yán)重障礙。與此同時(shí)，PCR檢測(cè)到CCR2 mRNA和MCP-1 mRNA在損傷后12 h、3 d的表達(dá)量急劇增加，提示MCP -1和CCR2 促進(jìn)趨化單核細(xì)胞向組織遷移，參與介導(dǎo)脊髓損傷早期的繼發(fā)性炎癥反應(yīng)。在SCC損傷后期，7 d和14 d 的BBB評(píng)分較早期逐漸增加，提示大鼠的運(yùn)動(dòng)功能逐漸恢復(fù)，但是仍然沒(méi)有恢復(fù)至正常值。與此同時(shí)， CCR2 mRNA和MCP-1 mRNA的表達(dá)量較脊髓損傷早期明顯下降。另外，IHC結(jié)果顯示MCP-1和CCR2在脊髓前角神經(jīng)元中均有表達(dá)，提示MCP-1和CCR2可能影響脊髓的運(yùn)動(dòng)功能。因此，筆者認(rèn)為，MCP-1和CCR2可能作為重要的因子參與脊髓損傷早期的繼發(fā)性損傷，MCP-1和CCR2在損傷后早期的急劇升高可能是導(dǎo)致SCC后早期大鼠運(yùn)動(dòng)功能障礙重要原因；SCC后期脊髓運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)可能與MCP-1和CCR2的降低有關(guān)。臨床上SCC后，炎癥反應(yīng)導(dǎo)致最嚴(yán)重的繼發(fā)性損傷就是脊髓液化性壞死。MCP-1可趨化炎癥細(xì)胞聚集于脊髓損傷部位，加重?fù)p傷部位的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致脊髓的液化性壞死，脊髓液化性壞死后修復(fù)形成瘢痕，導(dǎo)致脊髓功能障礙。由于SCC后早期，MCP-1與CCR2與脊髓的繼發(fā)性損傷密切相關(guān)，所以我們推測(cè)在臨床上治療脊髓損傷時(shí)，可以嚴(yán)密觀察和采用相應(yīng)的治療方法控制MCP-1和CCR2的表達(dá)，這可能對(duì)減少脊髓損傷后的繼發(fā)性反應(yīng)，促進(jìn)脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)具有重要的意義。Wang 等[12]通過(guò)多中心動(dòng)物SCI沖擊落錘試驗(yàn)裝置制備大鼠脊髓損傷模型，結(jié)果顯示脊髓損傷后1 d、3 d MCP-1的表達(dá)增加。李景田等人采用改良Allen撞擊法制作SD大鼠T9脊髓損傷模型，PCR結(jié)果顯示，脊髓損傷后 1 d、3 d MCP-1的表達(dá)增加，提示MCP-1可能會(huì)加重局部炎癥反應(yīng)[13]。Matsubara等[14]制備了大鼠脊髓挫傷模型，在急性脊髓損傷期間，將去除了MCP-1與唾液酸結(jié)合免疫球蛋白樣半乳糖凝集素-9(the secreted ectodomain of sialic acid-binding Ig-like lectin-9，ED-siglec-9)的人乳牙牙髓的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)鞘內(nèi)注射注射到大鼠脊髓損傷部位，發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細(xì)胞的表達(dá)減少且大鼠脊髓損傷后后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，結(jié)果提示抑制MCP-1和ED-siglec-9的含量來(lái)修復(fù)脊髓是通過(guò)減少誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的。上述研究與我們的觀點(diǎn)一致。另外，我們的研究顯示，大鼠SCC后CCR2 mRNA和MCP-1 mRNA的表達(dá)趨勢(shì)具有一致性，由此，筆者認(rèn)為SCC后MCP-1與CCR2共同作用介導(dǎo)脊髓損傷部位的繼發(fā)性炎癥反應(yīng)，引起病灶周?chē)恼＝M織發(fā)生破壞性病變，使SCC后早期運(yùn)動(dòng)功能障礙加重。

圖3 各組MCP-1和CCR2陽(yáng)性產(chǎn)物在脊髓前(A～F)、后角(G～L)的表達(dá)及定位，免疫組織化學(xué)顯色，×400，標(biāo)尺=50 μmFig 3 Expression and localization of MCP-1 and CCR2 positive products in the anterior(A～F) and posterior(G～L) horns of spinal cord in different group. Immunohistochemical staining, ×400, scale bar=50 μm

3.2 MCP-1和CCR2對(duì)SCC感覺(jué)功能的影響

大鼠脊髓損傷后溫痛覺(jué)測(cè)試結(jié)果顯示3 d和7 d組大鼠溫痛覺(jué)的潛伏期縮短，提示脊髓損傷大鼠有感覺(jué)功能障礙。PCR結(jié)果顯示CCR2 mRNA在損傷后3 d后增加，MCP-1 mRNA在損傷后3 d和7 d的表達(dá)量增加。IHC顯示MCP-1和CCR2主要在脊髓后角神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示大鼠SCC后MCP-1和CCR2表達(dá)量增加可能促進(jìn)趨化單核細(xì)胞的遷移，作為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元之間的信號(hào)分子，促進(jìn)中樞敏化，這可能是MCP-1和CCR2導(dǎo)致溫痛覺(jué)潛伏期縮短的重要原因。Krassioukov等[15]通過(guò)定量溫痛覺(jué)測(cè)試顯示人脊髓損傷后溫覺(jué)、冷覺(jué)和振動(dòng)覺(jué)閾值會(huì)下降。有研究報(bào)道采用熱板刺痛儀測(cè)試大鼠的后肢的痛覺(jué)潛伏期，發(fā)現(xiàn)脊髓損傷組大鼠后肢出現(xiàn)潛伏期縮短的現(xiàn)象[16]。另一研究發(fā)現(xiàn)甩尾反射檢測(cè)脊髓全橫斷模型小鼠甩尾時(shí)間均較假手術(shù)明顯縮短，出現(xiàn)感覺(jué)過(guò)敏[17]。Gao 等[18]結(jié)扎小鼠的L5脊神經(jīng)，發(fā)現(xiàn)脊神經(jīng)結(jié)扎引起的脊髓持續(xù)性神經(jīng)性疼痛中MCP-1在脊髓中的表達(dá)上調(diào)。孫繼虎[19]在慢性壓迫背根神經(jīng)節(jié)大鼠足底注射MCP-1，誘發(fā)了大鼠自發(fā)性疼痛行為且背根神經(jīng)節(jié)中CCR2的表達(dá)上調(diào)，提示MCP-1在神經(jīng)病理性疼痛中可通過(guò)增強(qiáng)外周痛覺(jué)感受器的敏感性、易化痛覺(jué)信號(hào)在脊髓的傳遞。綜上，我們認(rèn)為在脊髓損傷前期可以通過(guò)臨床干預(yù)MCP-1與CCR2的表達(dá)可以減輕脊髓損傷后溫痛覺(jué)功能的障礙，從而促進(jìn)患者感覺(jué)功能的恢復(fù)。

綜上所述，大鼠SCC后，損傷脊髓的運(yùn)動(dòng)功能早期下降、晚期逐漸恢復(fù)，溫痛覺(jué)潛伏期縮短。MCP-1與CCR2的表達(dá)趨勢(shì)與脊髓損傷后的功能變化基本一致，提示在SCC早期MCP-1與CCR2的表達(dá)和對(duì)單核細(xì)胞的影響可能是導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)功能障礙和感覺(jué)功能障礙的重要因素，為臨床早期治療SCC奠定基礎(chǔ)，為促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能與感覺(jué)功能的恢復(fù)提供精準(zhǔn)治療的靶點(diǎn)。