曹炳　沈志森　林樂希　郝文娟　周重昌

喉癌是呼吸系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤的第2位，僅次于肺癌[1]；國人發(fā)病率有明顯上升趨勢，且發(fā)病年齡趨于年輕化，尤其在北方地區(qū)[2]。喉鱗狀細(xì)胞癌（LSCC）是喉癌最常見的病理類型。喉癌的發(fā)生包括遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)兩大機制，以及吸煙、飲酒過度、病毒感染等因素的參與[3]。目前認(rèn)為，以抑癌基因啟動子異常甲基化（會導(dǎo)致基因沉默或失活）為代表的表觀遺傳學(xué)改變是腫瘤發(fā)生的重要機制之一，檢測腫瘤相關(guān)基因啟動子異常甲基化已逐步成為早期篩查腫瘤的常用方法[4-5]。人類CLDN11基因定位于3q26.2，其編碼的Claudin-11蛋白是完整的膜蛋白，為組成細(xì)胞緊密連接的主要成分，而緊密連接蛋白的異常表達(dá)被認(rèn)為是腫瘤進(jìn)展的重要一步[6]。CLDN11基因表達(dá)下調(diào)會增強腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲能力，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展[7]，如腦膜瘤[8]、胃癌[7]、惡性黑色素瘤[9]、口腔癌[10]、皮膚黑色素瘤[9]等。然而，CLDN11基因啟動子甲基化與喉癌的關(guān)系報道少見?；诖耍狙芯刻接慍LDN11基因啟動子在LSCC組織中的甲基化水平，分析其與LSCC臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，并評估其對LSCC的診斷價值，現(xiàn)報道如下。

1　對象和方法

1.1對象選取2011年1月至2016年1月在寧波大學(xué)附屬李惠利醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科住院治療的LSCC患者91例，其中男87例，女4例；年齡40～86歲，中位年齡60歲；吸煙者73例?；颊咝g(shù)前均未接受放化療，既往無癌癥史。臨床分期采用國際抗癌協(xié)會（UICC）TNM分期標(biāo)準(zhǔn)（2002），并由2位病理科醫(yī)師進(jìn)行組織學(xué)確認(rèn)，其中Ⅰ、Ⅱ期44例，Ⅲ、Ⅳ期47例；高中分化鱗癌78例，低分化鱗癌13例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移32例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移59例。手術(shù)切取LSCC組織及距癌組織邊緣0.5cm以上的癌旁正常組織立即放入液氮中，并轉(zhuǎn)入-80℃冰箱冷凍保存。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2DNA提取和亞硫酸氫鹽修飾根據(jù)制造商的說明書，使用QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen,Hilden,Germany）從LSCC組織及癌旁正常組織標(biāo)本中提取基因組DNA。使用NanoDrop 1000分光光度計（Thermo Fisher Scientific Co.Ltd.,Wilmington，USA）評估DNA質(zhì)量和數(shù)量，樣品在260/280nm吸光度比值為1.8～2.0，則認(rèn)為提取的DNA純度較滿意。根據(jù)制造商的說明書（Zymo Research,Orange,CA,USA），使用具有ZYMO EZ DNA Methylation-Gold Kit的Methylamp DNA修飾試劑盒將洗脫的DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾。

1.3CLDN11基因啟動子甲基化水平測定采用實時熒光定量甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（qMSP）法。根據(jù)儀器指南，使用LightCycler 480（Roche Diagnostics,Mannheim,Germany）擴(kuò)增亞硫酸氫鹽修飾的DNA。qMSP所需引物：CLDN11-正義5′-ATAAGTTGATAGGAGAATCGAATCG-3′，CLDN11-反義5′-AACGAAAATAACCCTAAACACGTA-3′。內(nèi)參為β-actin基因（ACTB），ACTB-正義5′-TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT-3′，ACTB-反義5′-AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA-3′。PCR反應(yīng)體系為20μl，包括雙蒸水（ddH2O）6μl，模板DNA 2μl，PCR Buffer 10μl，上下游引物各1μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10min，95℃20s，60℃30s，72℃30s，共50個循環(huán)。采用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化通用甲基化人類DNA標(biāo)準(zhǔn)（ZYMO研究公司）作為陽性對照。為了糾正樣品質(zhì)量和數(shù)量之間的差異，ACTB被用作內(nèi)部控制。qMSP通過甲基化指數(shù)（PMR）進(jìn)行指標(biāo)量化。PMR代表基因甲基化陽性的模板DNA在其中所占的比例，實驗中分別將每個樣本的甲基化Ct值，陽參和內(nèi)參的Ct值代入以下公式計算得出：PMR=2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=（Ct樣本-Ct內(nèi)參）-（Ct陽參-Ct內(nèi)參）。

1.4觀察指標(biāo)（1）比較LSCC組織與癌旁正常組織CLDN11基因啟動子甲基化水平。（2）分析LSCC組織CLDN11基因啟動子甲基化水平與臨床病理特征的關(guān)系[11]，包括性別、年齡、有無吸煙、癌組織學(xué)類型、臨床分期、T分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。（3）評估CLDN11基因啟動子甲基化水平對LSCC的診斷價值。（4）以甲基化水平0.571為臨界值，將患者分為高甲基化組（30例）和低甲基化組（61例）[12]。隨訪至2017年8月，分析LSCC組織CLDN11基因啟動子甲基化水平與患者預(yù)后的關(guān)系。1.5統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計軟件；計量資料以表示，LSCC組織與癌旁正常組織CLDN11基因啟動子甲基化水平比較采用配對t檢驗，不同臨床病理特征的LSCC組織CLDN11基因啟動子甲基化水平比較采用兩獨立樣本t檢驗；繪制ROC曲線評估CLDN11基因啟動子甲基化水平對LSCC的診斷價值，得出AUC、靈敏度、特異度；采用Kaplan-Meier法估計高甲基化組與低甲基化組患者的生存率并繪制生存曲線，兩組患者生存率的比較采用log-rank檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1LSCC組織與癌旁正常組織CLDN11基因甲基化水平比較見圖1。

由圖1可見，LSCC組織CLDN11基因甲基化水平明顯高于癌旁正常組織[（0.256±0.219）vs（0.060±0.090）,P＜0.01]。

2.2LSCC組織CLDN11基因啟動子甲基化水平與臨床病理特征的關(guān)系見表1。

由表1可見，LSCC組織CLDN11基因啟動子甲基化水平與患者性別、年齡、有無吸煙、癌組織學(xué)類型均無關(guān)（均P＞0.05），Ⅲ、Ⅳ期、T3～4期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的LSCC組織CLDN11基因啟動子甲基化水平分別高于Ⅰ、Ⅱ期、T1～2期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的LSCC組織（均P＜0.01）。

2.3CLDN11基因啟動子甲基化水平對LSCC的診斷價值見圖2。

由圖2可見，AUC為0.884（95%CI：0.835～0.932,P＜0.01），甲基化水平為0.571時，診斷LSCC的靈敏度、特異度分別為0.923、0.736。

圖1　LSCC組織與癌旁正常組織CLDN11基因甲基化水平比較

表1　LSCC組織CLDN11基因啟動子甲基化水平與臨床病理特征的關(guān)系

圖2　CLDN11基因啟動子甲基化水平診斷LSCC的ROC曲線（箭頭示PMR最佳截斷點）

2.4LSCC組織CLDN11基因啟動子甲基化水平與患者預(yù)后的關(guān)系見圖3。

圖3　LSCC組織CLDN11基因啟動子高甲基化組與低甲基化組患者生存曲線比較

由圖3可見，與低甲基化組患者相比，高甲基化組患者總生存率較低（P＜0.01）。

3　討論

CLDN11基因編碼的Claudin-11蛋白屬于Claudins家族成員之一，Claudins蛋白的表達(dá)下降可能會降低細(xì)胞黏附，促進(jìn)腫瘤發(fā)生[13]，已在小鼠皮膚腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中得到證實[14]。本研究分析CLDN11基因與LSCC的關(guān)系。LSCC患者早期往往無特異性臨床癥狀，特別是聲門上癌。LSCC患者常通過CT、MRI和內(nèi)鏡病理組織活檢來進(jìn)行診斷。然而，CT和MRI對LSCC診斷的靈敏度和特異度不是很理想，很少有LSCC患者通過CT或MRI可明確診斷。內(nèi)鏡病理組織活檢仍然是診斷LSCC的金標(biāo)準(zhǔn)，然而這種方法由于其侵入性而受到限制，并且不適用于大規(guī)模篩查。因此，迫切需要進(jìn)一步研究LSCC的發(fā)生機制，并尋找潛在的LSCC生物標(biāo)志物來提高早期診斷率。

抑癌基因啟動子異常甲基化可能是腫瘤發(fā)生的早期事件。近年來，大量研究表明CLDN11基因啟動子異常甲基化在腫瘤發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。Agarwal等[7]發(fā)現(xiàn)與其對應(yīng)的癌旁正常組織相比，胃癌組織中CLDN11基因啟動子甲基化水平明顯升高，而CLDN11基因表達(dá)明顯下調(diào)，從而通過增加腫瘤細(xì)胞的運動和侵襲性促進(jìn)胃癌的形成。Walesch等[9]報道與皮膚正常上皮和發(fā)育異常痣相比，惡性黑色素瘤的CLDN11基因啟動子甲基化水平顯著升高。此外，Abe等[10]認(rèn)為CLDN11基因啟動子異常甲基化與高危口腔白斑有關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與癌旁正常組織相比，LSCC組織CLDN11基因啟動子甲基化水平明顯增高。這提示CLDN11基因啟動子甲基化是LSCC常見的特異性事件，并且有可能作為LSCC早期診斷的生物標(biāo)志物。

腫瘤的臨床分期與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是頭頸部鱗狀細(xì)胞癌重要的預(yù)后指標(biāo)，極大地影響患者的生存率及治療方案的選擇[15]。本研究發(fā)現(xiàn)CLDN11基因啟動子甲基化水平在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床Ⅲ、Ⅳ期和T3～4分期患者中明顯升高，表明CLDN11基因啟動子甲基化可能在疾病進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

對于頭頸部腫瘤，目前已經(jīng)評估了幾種生物標(biāo)志物，以改善診斷和隨訪，包括癌胚抗原（CEA）、組織多肽抗原（TPA-M）、鱗狀細(xì)胞癌抗原（SCCA）和細(xì)胞角蛋白19片段（CYFRA 21-1）。Eleftheriadou等[16]報道，CEA、TPA-M、SCCA和CYFRA 21-1在LSCC診斷中的靈敏度為0.165～0.468。本研究結(jié)果顯示，CLDN11基因啟動子甲基化水平為0.571時，診斷LSCC的靈敏度、特異度分別為0.923、0.736。這表明CLDN11基因啟動子甲基化對LSCC有較高的診斷價值。

抑癌基因啟動子高甲基化與腫瘤的的低生存率有關(guān)[17]，Meng等[18]發(fā)現(xiàn)CLDN11基因的表達(dá)水平與乳腺癌患者的生存率密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與CLDN11基因啟動子低甲基化組患者相比，高甲基化組患者總生存率較低。這表明異常甲基化的CLDN11基因可能是預(yù)測LSCC患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。

不可否認(rèn)，本研究尚有不足之處。首先，本研究只包含91例樣本，需要更大樣本、多中心研究進(jìn)一步驗證結(jié)果；其次，本研究未檢測CLDN11基因的蛋白表達(dá)水平，今后的研究可考慮。

綜上所述，LSCC組織中CLDN11基因啟動子呈高甲基化水平，且在Ⅲ、Ⅳ期、T3～4期及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中明顯增高。此外，CLDN11基因啟動子高甲基化LSCC患者的總生存率低。CLDN11基因啟動子高甲基化或可作為LSCC診斷和預(yù)測預(yù)后的生物標(biāo)志物。

[1]Siegel RL,Miller KD,Jemal A．Cancer statistics,2017[J]．CA Cancer J Clin,2017,67(1)：7-30．

[2]Chen K,Song F,He M,et al．Trends in head and neck cancer incidence in Tianjin,China,between 1981 and 2002[J]．Head Neck,2009,31(2)：175-182．

[3]何麗霞,季文樾,楊靜,等．喉癌流行病學(xué)特征及影響因素分析[J]．中國當(dāng)代醫(yī)藥,2015,22(12)：44-46．

[4]Choudhury JH,Ghosh SK．Promoter hypermethylation profiling identifies subtypes of head and neck cancer with distinct viral,environmental,genetic and survival characteristics[J]．PLoS One,2015,10(6)：e0129808．

[5]Herman D,Leakey TI,Behrens A,et al．CHST11 gene expression and DNA methylation in breast cancer[J]．Int J Oncol,2015,46(3)：1243-1251．

[6]Morin PJ．Claudin proteins in human cancer：promising new targets for diagnosis and therapy[J]．Cancer Res,2005,65(21)：9603-9606．

[7]Agarwal R,Mori Y,Cheng Y,et al．Silencing of claudin-11 is associated with increased invasiveness of gastric cancer cells[J]．PLoS One,2009,4(11)：e8002．

[8]Soini Y,Rauramaa T,Alafuzoff I,et al．Claudins 1,11 and twist in meningiomas[J]．Histopathology,2010,56(6)：821-824．

[9]Walesch SK,Richter AM,Helmbold P,et al．Claudin11 promoter hypermethylation is frequent in malignant melanoma of the skin,but uncommon in nevus cell nevi[J]．Cancers(Basel),2015,7(3)：1233-1243．

[10]Abe M,Yamashita S,Mori Y,et al．High-risk oral leukoplakia is associated with aberrant promoter methylation of multiple genes[J]．BMC Cancer,2016,16(1)：350．

[11]Vedeld HM,Skotheim RI,Lothe RA．The recently suggested intestinal cancer stem cell marker DCLK1 is an epigenetic biomarkerfor colorectal cancer[J]．Epigenetics,2014,9(3)：346-350．

[12]Wang ZR,Wei JH,Zhou JC,et al．Validation of DAB2IP methylation and its relative significance in predicting outcome in renal cell carcinoma[J]．Oncotarget,2016,7(21)：31508-31519．

[13]Mullin JM．Potential interplay between luminal growth factors and increased tight junction permeability in epithelial carcinogenesis[J]．J Exp Zool,1997,279(5)：484-489．

[14]Arabzadeh A,Troy TC,Turksen K．Changes in the distribution pattern of Claudin tight junction proteins during the progression of mouse skin tumorigenesis[J]．BMC Cancer,2007,7(1)：196．

[15]Baatenburg de Jong RJ,Hermans J,Molenaar J．Prediction of survival in patients with head and neck cancer[J]．Head Neck,2001,23(9)：718-724．

[16]Eleftheriadou A,Chalastras T,Ferekidou E．Clinical effectiveness of tumor markers in squamous cell carcinoma of the larynx[J]．Anticancer Res,2006,26(3B)：2493-2497．

[17]Peters I,Gebauer K,Dubrowinskaja N．GATA5 CpG island hypermethylation is an independent predictor for poor clinical outcomeinrenalcellcarcinoma[J]．OncolRep,2014,31(4)：1523-1530．

[18]Meng L,Xu Y,Xu C．Biomarker discovery to improve prediction of breast cancer survival：using gene expression profiling,meta-analysis,and tissuevalidation[J]．OncoTargets Ther,2016,9：6177-6185．