孫海波 劉雙 宋亦春 王璐璐 孫佰紅 毛玲玲 孫英偉

【摘要】 目的 分析遼寧省2016～2017流感年度H3N2亞型流感病毒M2蛋白和神經(jīng)氨酸酶（NA）基因特點， 了解并掌握該年度省內(nèi)流感毒株對烷胺類藥物及NA抑制劑類藥物的耐藥情況， 為流感的治療及防控提供科學依據(jù)。方法 選取遼寧省內(nèi)各市流感樣病例， 經(jīng)病毒分離獲得的甲型H3N2亞型流感毒株55株， 對M2基因及NA基因進行擴增并測序后對耐藥位點進行分析。結果 2016年4月～2017年3月， 遼寧省共采集流感樣病例標本13956份， 分離流感毒株1528株。其中甲型流感毒株835株， H3N2亞型毒株378株， 約占甲型流感毒株的45.3%。測序獲得55株H3N2亞型流感毒株的M2基因片段（第572～1027核酸位點和NA基因片段（第1～914位核苷酸位點）核苷酸序列。經(jīng)比對分析， 全部檢出S31N突變， 對烷胺類藥物均表現(xiàn)為耐藥。此外， 所有毒株的第51位均發(fā)生了異亮氨酸到纈氨酸的突變。NA基因耐藥位點均未檢出突變， 未發(fā)現(xiàn)NA抑制劑類藥物的耐藥株。結論 遼寧省2016～2017年流行的甲型H3N2亞型流感病毒普遍對烷胺類藥物耐藥， 未發(fā)現(xiàn)NA抑制劑類藥物的耐藥株。因此， 奧司他韋等NA抑制劑類藥物是治療H3N2型流感的敏感藥物。但在實際工作中仍應對耐藥性進行監(jiān)測， 實時關注耐藥株的產(chǎn)生。

【關鍵詞】 甲型H3N2亞型流感；耐藥性分析；烷胺類藥物；神經(jīng)氨酸酶抑制劑

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2018.09.117

流感病毒是引起流行性感冒的病原體， 常在北方冬春季引起暴發(fā)或流行。全球監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示， 在季節(jié)性流感病毒中， 甲型H3N2亞型流感病毒能夠引起人群更為嚴重的呼吸道癥狀[1， 2]。2016～2017年遼寧省流感流行呈現(xiàn)甲型H1N1和H3N2亞型共流行的情況。甲型H3N2流感病毒與新甲型H1N1流感病毒所導致的疾病負擔相似[3]， 因而應時刻關注H3N2亞型流感病毒的流行情況及耐藥情況。目前， 流感疫苗是用于流感預防的最佳手段。但由于人群接種率低， 抗病毒藥物依然是治療和預防流感的主要措施?，F(xiàn)階段國內(nèi)常用的抗流感病毒藥物主要有M2蛋白抑制劑和NA抑制劑兩大類。經(jīng)過多年耐藥監(jiān)測發(fā)現(xiàn)， 流感病毒對烷胺類藥物耐藥比例不斷升高， 至今幾乎全部耐藥；NA抑制劑類藥物的耐藥株也呈增加趨勢， 因此， 流感毒株耐藥監(jiān)測工作對流感的治療及預防具有十分重要的意義。本研究對2016～2017年遼寧省甲型H3N2亞型流感病毒的耐藥情況進行分析， 為流感防治工作奠定基礎?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1. 1 標本來源 采集2016年4月～2017年3月遼寧省各國家級監(jiān)測哨點醫(yī)院流感樣病例標本。

1. 2 病毒分離 采用狗腎細胞（MDCK）進行病毒分離。細胞病變后使用紅細胞凝集方法進行試驗， 滴度>1∶8的毒株用紅細胞凝集抑制試驗進行分型（試劑由國家流感中心提供）。研究所用毒株均經(jīng)過國家流感中心復核鑒定。

1. 3 毒株選擇 選取55株不同地區(qū)國家級哨點醫(yī)院采集的流感樣病例標本分離得到的甲型H3N2亞型流感毒株。

1. 4 核酸提取 使用EZ1 Virus Mini Kit V2.0（cat.No.955134）試劑盒進行核酸提取， 提取量60 μl。核酸提取后立即使用或置于-70℃凍存。

1. 5 聚合酶鏈式反應（PCR）檢測 M2基因引物序列[4]為MF：5‘-CAGGTAGATATTGAAAGAT-3；MR：5-GTAGAAACAAGGTAGTTTT-3；NA基因引物序列[5]為NaF：5‘-GCAAAAGCAGGAGTGAAAR-3；NaR：5-ATATCTACTATGGGCCTATTGGA-3。以上引物均由invitrogen公司合成。

1. 6 逆轉(zhuǎn)錄（RT）-PCR反應 擴增毒株的M2基因和NA基因。采用Qiagen one-step PCR kit進行擴增。反應條件：50℃反轉(zhuǎn)錄30 min；95℃滅活反轉(zhuǎn)錄酶15 min；94℃ 30 s， 55℃ 60 s， 72℃ 60 s共40個循環(huán)；72℃ 10 min延伸；4℃保持。反應設置陰陽性對照。擴增產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1. 7 核酸測序 PCR擴增產(chǎn)物送invitrogen公司進行核苷酸雙向測序。

1. 8 序列分析 采用Bioedit、DNAstar和Mega6.0分析軟件對M2基因和NA基因序列分析和氨基酸序列的同源性分析。通過耐藥的分子標記鑒定耐藥株。據(jù)報道， 與M2基因耐藥有關的分子標記有L26F、V27A、A30T、S31N和G34E[6]。與NA基因耐藥有關的分子標記有E119V、Q136K、D151A、I222V、H274Y、R292K和N294S[7]。只要上述位點中有任意位點發(fā)生突變， 病毒即產(chǎn)生耐藥性。

2 結果

2. 1 病毒流行情況 2016年4月～2017年3月遼寧省共采集流感樣病例標本13956份， 分離流感毒株1528株。其中甲型流感毒株835株， H3N2亞型毒株378株， 約占甲型流感毒株的45.3%。

2. 2 耐藥位點分析 測序獲得55株H3N2亞型流感毒株的M2基因片段（第572～1027核酸位點和NA基因片段（第1～914位核苷酸位點）核苷酸序列。經(jīng)比對分析， 全部檢出S31N突變， 對烷胺類藥物均表現(xiàn)為耐藥。此外， 所有毒株的第51位均發(fā)生了異亮氨酸到纈氨酸的突變。NA基因耐藥位點均未檢出突變， 未發(fā)現(xiàn)NA抑制劑類藥物的耐藥株。耐藥位點檢出情況。見表1。

3 討論

流行性感冒是主要的呼吸道傳染病之一， 多發(fā)于冬春季節(jié)。由于流感疫苗相對于流感的流行存在滯后現(xiàn)象， 因此抗病毒藥物成為治療流感的重要手段[8]。研究表明， 流感患者在發(fā)病初期48 h內(nèi)進行抗病毒治療能夠有效的縮短病程及發(fā)熱時間[9]， 對于流感的治療具有十分重要的意義。

流感病毒的抗病毒藥物包括烷胺類藥物和NA抑制劑類兩類。烷胺類藥物最早于1966年被美國FDA批準用于甲型流感的治療， 因療效顯著且價格合理而被廣泛使用， 隨之而來的是烷胺類藥物耐藥性逐年增加， 至2005年底我國該類藥物的耐藥率已經(jīng)達到100%。但也有研究證實， 由于流感病毒極易發(fā)生重組引起突變， 導致耐藥率有所降低， 如加拿大耐藥率曾由100%下降到了30.1%。因此， 甲型流感病毒烷胺類藥物耐藥監(jiān)測仍具有重要意義。NA抑制劑類藥物在我國流感治療中的應用也日漸廣泛。目前臨床上被批準使用的NA抑制劑類藥物有扎那米韋和磷酸奧司他韋兩種， 奧司他韋（達菲）已經(jīng)成為預防和治療流感的主要制劑。近年來， NA抑制劑類藥物的敏感株不斷出現(xiàn)， 如1例H7N9患者檢測到NA序列中攜帶K294R突變位點并引起耐藥[10]。由此推測， NA抑制劑的使用可能導致耐藥株的出現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)， NA基因第274位和294位突變能夠?qū)е聦W司他韋和帕拉米韋耐藥， 第152位導致對扎那米韋耐藥， 第119位突變導致對奧司他韋和扎那米韋耐藥[11]。此外， I222V可以引起中等強度的耐藥， 與E119V突變協(xié)同作用能提高H3N2亞型流感病毒對奧司他韋的耐藥水平[12]。

本研究顯示， 2016～2017年遼寧省流行的流感病毒以甲型為主， 其中H3N2亞型占45.3%。并且， 近年來持續(xù)有H3N2亞型流感病毒流行。經(jīng)氨基酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)， 所選的55株流感毒株均對烷胺類藥物耐藥， 對NA抑制劑類藥物敏感。據(jù)統(tǒng)計， 近年來甲型流感病毒普遍對烷胺類藥物耐藥， 因此烷胺類藥物在近期流感的抗病毒治療中意義不大， 臨床治療推薦使用NA抑制劑類藥物。但由于流感病毒不斷變異， 仍然可能有烷胺類藥物敏感株的出現(xiàn)甚至流行， 因此仍有繼續(xù)監(jiān)測的意義和必要。NA抑制劑類藥物在臨床的廣泛應用， 導致近年來不斷出現(xiàn)NA抑制劑的流感及禽流感耐藥株。本次研究所選毒株中尚未發(fā)現(xiàn)NA基因耐藥位點發(fā)生變異， 但由于NA抑制劑類藥物在臨床治療中的重要性， 應持續(xù)開展長期的監(jiān)測， 以期發(fā)現(xiàn)有意義的變異， 及時有效的指導臨床用藥， 為流感防控提供數(shù)據(jù)依據(jù)及技術支持。

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[收稿日期：2017-12-08]