王顥潛 陳銳 李夏瑩 王夢(mèng)雨 劉鵬程

（1. 農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心，北京 100176；2. 天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，天津 300192；3. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，北京 100193）

轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用與發(fā)展十分迅猛，已成為世界各國農(nóng)業(yè)科技競(jìng)爭(zhēng)的焦點(diǎn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化21 年間（從1996-2016年），全球轉(zhuǎn)基因作物的商業(yè)化種植面積持續(xù)增長，累計(jì)達(dá)到了21 億hm2，這使轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)成為近年來應(yīng)用最為迅速的作物技術(shù)［1］。轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)給人類帶來了巨大經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)也引發(fā)了社會(huì)關(guān)于轉(zhuǎn)基因植物安全性問題的爭(zhēng)議，鑒于食用安全長期效應(yīng)無法確證等問題，當(dāng)前的研究成果尚不能對(duì)轉(zhuǎn)基因安全給出準(zhǔn)確、全面的結(jié)論。為加強(qiáng)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的管理，世界各國都在積極完善和落實(shí)相應(yīng)的法律法規(guī)。但是，目前不同國家和地區(qū)的轉(zhuǎn)基因法律法規(guī)、標(biāo)識(shí)制度、閾值范圍和管理方式上存在較大差異，對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的進(jìn)出口檢驗(yàn)、國際貿(mào)易互認(rèn)等方面造成了較大的影。由此可見，轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)的需求是一直存在的，并隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用的快速發(fā)展顯得尤為迫切。開發(fā)便捷、高效的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法，尤其是精準(zhǔn)的定量檢測(cè)技術(shù)，建立相應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)體系對(duì)促進(jìn)轉(zhuǎn)基因農(nóng)業(yè)發(fā)展、保護(hù)我國農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)出口貿(mào)易利益、滿足轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管需求以及完善轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)管理制度等方面意義重大。目前國內(nèi)外對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)技術(shù)根據(jù)檢測(cè)原理的分為兩類，即基于外源核酸的檢測(cè)技術(shù)和基于外源蛋白的檢測(cè)技術(shù)。本文就轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品成分檢測(cè)技術(shù)的原理、優(yōu)缺點(diǎn)、研究進(jìn)展和發(fā)展方向做一簡要概述，旨在促進(jìn)我國轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品成分檢測(cè)技術(shù)更好地適應(yīng)當(dāng)前轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域的發(fā)展和滿足轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管的需求。

1 基于外源核酸的檢測(cè)技術(shù)

核酸是絕大多數(shù)生命體的遺傳物質(zhì)，具有較高的穩(wěn)定性和普遍性，因此以脫氧核糖核酸（DNA）為靶標(biāo)的檢測(cè)技術(shù)是目前最成熟、應(yīng)用最廣泛的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)［2］。根據(jù)外源DNA片段序列特征和插入位置的不同，核酸檢測(cè)可以對(duì)篩選元件特異性、基因特異性、載體構(gòu)建特異性和轉(zhuǎn)化事件特異性四個(gè)方面進(jìn)行檢測(cè)［3-5］。基于外源核酸的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)主要有：定性PCR技術(shù)、定量PCR技術(shù)、等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和基因芯片技術(shù)等。

1.1 定性PCR技術(shù)

定性PCR也稱為普通PCR（Conventional PCR），是一種基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的檢測(cè)技術(shù)，是目前應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)最廣泛的方法［6］。此法不受材料加工程度的影響，可以對(duì)種子到終產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行定性檢測(cè)，且靈敏度高、操作簡便，成為許多國家用于市場(chǎng)篩查轉(zhuǎn)基因成分的首選方法，如巴西［7］、科威特［8］、伊朗［9］、沙特阿拉伯［10］、約旦［11］、塞爾維亞［12］及敘利亞［13］等國家。

普通PCR單次反應(yīng)只能檢測(cè)特定靶序列，無法滿足大量、快速的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)需求。以常規(guī)PCR方法為基礎(chǔ)改進(jìn)PCR方法也得到了廣泛的應(yīng)用。例如，多重PCR（Multiplex PCR）在檢測(cè)通量和成本控制方面具備優(yōu)勢(shì)，近年來也被廣泛關(guān)注和深入研究。Datukishvili等［14］針對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆開發(fā)了4重PCR體系，能夠同時(shí)檢測(cè)CaMV35S 啟動(dòng)子、NOS終止子、epsps基因與大豆內(nèi)源基因lectin，還開發(fā)了轉(zhuǎn)基因玉米3重PCR體系，能夠同時(shí)檢測(cè)啟動(dòng)子、cry1Ab基因和玉米內(nèi)源基因zein，該方法特異性良好，并且靈敏度均能達(dá)到0.1%；Harikai等［15］結(jié)合多重PCR與引物延伸的方法，將生物素標(biāo)記的核酸 dUTP混入到引物延伸產(chǎn)物中，可直接光學(xué)檢測(cè)8重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測(cè)時(shí)間短，靈敏度可達(dá)1%；Mano等［16］將多重PCR與多重連接酶擴(kuò)增反應(yīng)（Multiplex ligase chain reaction，LCR）偶聯(lián)，針對(duì)7個(gè)轉(zhuǎn)基因元件和3個(gè)內(nèi)源基因開發(fā)出了高效的多重轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法；Patwardhan等［17］開發(fā)了多重PCR-毛細(xì)管電泳方法可同時(shí)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因棉花MON531、轉(zhuǎn)基因馬鈴薯EH 92-527-1、轉(zhuǎn)基因玉米Bt176、轉(zhuǎn)基因玉米GA21和轉(zhuǎn)基因油菜GT73 canola，檢測(cè)低限為0.1%。

對(duì)于普通PCR靈敏度不高，對(duì)含量低、成分復(fù)雜和被嚴(yán)重破壞的DNA樣品難以準(zhǔn)確檢測(cè)的缺點(diǎn)，在普通PCR的基礎(chǔ)上開發(fā)出了巢式PCR（Nested PCR）和半巢式PCR（Semi-Nested PCR）技術(shù)。該技術(shù)的原理是在擴(kuò)增產(chǎn)物的片段上引入新的引物，通過二次擴(kuò)增反應(yīng)對(duì)某段序列進(jìn)行檢測(cè)，以提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度和靈敏性。敖金霞等［18］建立了適用于轉(zhuǎn)基因大豆、玉米及水稻深加工產(chǎn)品的五重巢式PCR 技術(shù)，檢測(cè)靈敏度為0.005%；閆偉等［19］建立的單管巢式和半巢式PCR方法可準(zhǔn)確、高效地檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米MON89034及其產(chǎn)品，此方法的相對(duì)檢出限達(dá)到0.01%，絕對(duì)檢出限為4個(gè)單倍體基因組拷貝數(shù)，比普通PCR提高了5倍。

隨著定性PCR技術(shù)的發(fā)展，熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR、連接介導(dǎo)PCR和反向PCR在轉(zhuǎn)基因分子鑒定和單鏈DNA制備等方面開始廣泛應(yīng)用［20-21］。

1.2 定量PCR技術(shù)

目前，越來越多的國家通過設(shè)定閾值對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)識(shí)管理，轉(zhuǎn)基因成分含量超過設(shè)定閾值的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品必須強(qiáng)制性標(biāo)識(shí)，如歐盟為0.9%，澳大利亞、巴西為1%，馬來西亞、韓國為3%，日本、中國臺(tái)灣為5%［22-23］。隨著世界各國轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)制度的發(fā)展和完善，應(yīng)用定量PCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行定量標(biāo)識(shí)將越來越廣泛［24］。定量PCR技術(shù)主要有競(jìng)爭(zhēng)性定量PCR技術(shù)（Competitive quantitative PCR，QC-PCR）、實(shí)時(shí)定量 PCR技術(shù)（Real-time fluorescence quantitative PCR，qPCR） 和數(shù)字PCR技術(shù)（Digital PCR，dPCR）3種。

1.2.1 競(jìng)爭(zhēng)性定量PCR技術(shù) 競(jìng)爭(zhēng)性定量PCR通過向PCR反應(yīng)體系中加入與目標(biāo)DNA具有相同擴(kuò)增效率和引物結(jié)合位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)模板，同時(shí)以不同稀釋梯度的競(jìng)爭(zhēng)模板建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計(jì)算目標(biāo)DNA的含量［2，23］。Garcíaca?as等［25］將 QC-PCR 方法與毛細(xì)管電泳激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)巧妙結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了玉米Bt176品系的定量檢測(cè)；Mavropoulou等［26］研究證明QC-PCR比實(shí)時(shí)定量PCR靈敏度高且探針價(jià)格低廉。QC-PCR技術(shù)的難點(diǎn)在于競(jìng)爭(zhēng)模板的設(shè)計(jì)。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù) 實(shí)時(shí)定量PCR通過熒光標(biāo)記實(shí)時(shí)監(jiān)控目的片段的擴(kuò)增，根據(jù)待測(cè)物起始濃度與Ct（Threshold Cycle）值線性相關(guān)的原理，從而實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)基因的精確定量，已廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的定量檢測(cè)［27］。qPCR試驗(yàn)中，選擇恰當(dāng)?shù)膬?nèi)源基因并驗(yàn)證特異引物是定量檢測(cè)的關(guān)鍵因素［28］。目前，qPCR檢測(cè)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于大豆［29］、玉米［30］、水稻［31］、菜豆［32］、棉花［33］、茄子［5］、木瓜［34］和釀酒酵母［35］的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)，具備良好的特異性和較高的靈敏度。隨著規(guī)模化和快速化轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的需求，多重qPCR技術(shù)得到了發(fā)展。D?rries等［36］針 對(duì) P-35S、T-NOS、bar和 FMV35S設(shè)計(jì)了多重定量PCR預(yù)混液，檢測(cè)低限均能達(dá)到10個(gè)拷貝，并且在41個(gè)非轉(zhuǎn)基因植物中驗(yàn)證其特異性良好；Li等［37］設(shè)計(jì)了四重定量PCR可同時(shí)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因棉花GHB119 的T304-40的事件特異性與外源基因Cry2Ae，檢出限為10個(gè)拷貝，定量限為20-25個(gè)拷貝。qPCR具有操作簡便、靈敏度高，但成本較高，存在重現(xiàn)性較差的問題。

1.2.3 數(shù)字PCR技術(shù) 數(shù)字PCR是一種基于泊松分布原理的針對(duì)單分子目標(biāo)DNA的絕對(duì)定量技術(shù)［38］。相對(duì)qPCR技術(shù)，dPCR不需要對(duì)每個(gè)循環(huán)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光測(cè)定，也不需要Ct值來定量靶標(biāo)。dPCR通過將反應(yīng)試劑平均分配到幾萬至上千萬個(gè)單元中，從而使靶標(biāo)DNA稀釋到單分子水平。擴(kuò)增結(jié)束后，通過直接計(jì)數(shù)或泊松分布計(jì)算得到樣品的原始拷貝數(shù)，因此其不受擴(kuò)增效率的影響，也不必使用內(nèi)參基因和標(biāo)準(zhǔn)曲線，具有極高的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性。目前，dPCR 已應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因玉米［39］、水稻［40］、大豆［41］及深加工產(chǎn)品［42］中的定量檢測(cè)中。

當(dāng)前的dPCR技術(shù)平臺(tái)主要有兩種，一種是基于固態(tài)平臺(tái)開發(fā)的芯片式數(shù)字PCR技術(shù)，由Fluidigm公司基于集成流體通路（IFC）芯片與Life Technologies的OpenArray為代表；另一種是基于液體微滴的數(shù)字PCR技術(shù)，由Bio-Rad公司和RainDance公司產(chǎn)品為代表。Li等［43］基于Fluidigm公司開發(fā)的動(dòng)態(tài)芯片技術(shù)建立了高通量數(shù)字PCR轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法，可同時(shí)檢測(cè)48個(gè)樣本中的48個(gè)靶標(biāo)基因，包括7個(gè)轉(zhuǎn)基因元件、36個(gè)事件特異性基因和5個(gè)內(nèi)源基因，為克服基因組DNA上樣拷貝數(shù)稀少的問題，該研究還利用8-14個(gè)循環(huán)的預(yù)擴(kuò)增來優(yōu)化檢測(cè)方法，最終的檢測(cè)低限為0.05 ng。

dPCR特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高，常用來確定轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量值。Corbisier等［44］利用dPCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米MON810的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行拷貝數(shù)測(cè)定，結(jié)果表明dPCR相對(duì)qPCR在絕對(duì)定量方面具備優(yōu)勢(shì)，可用于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的校正；Liang等［45］利用Fluidigm平臺(tái)對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻kefeng6的質(zhì)粒參考物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，同樣證實(shí)數(shù)字PCR可用于轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的拷貝數(shù)驗(yàn)證。目前，美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究 院（National Institute of Standards and Technology，NIST）已開發(fā)出全球首例由dPCR校準(zhǔn)的DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，可用于人類巨細(xì)胞病毒的溯源和檢測(cè)結(jié)果比對(duì)［46］。

最新的研究表明，dPCR技術(shù)還是檢驗(yàn)外源插入基因拷貝數(shù)和純合性的有效方法。Glowacka等［47］在轉(zhuǎn)基因煙草中比較了Southern blot、熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR、定量PCR和數(shù)字PCR等方法，用于分析插入的T-DNA拷貝數(shù)、位點(diǎn)復(fù)雜性和純合性，結(jié)果表明dPCR與Southern blot結(jié)果一樣可靠，并且在試驗(yàn)操作上更加快速和便捷。雖然目前來看dPCR技術(shù)存在成本昂貴等缺陷，但其絕對(duì)定量的屬性在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中有著廣闊前景。

1.3 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是指在一個(gè)恒定溫度下，通過不同活性的酶和各種特異性引物來實(shí)現(xiàn)DNA擴(kuò)增的方法，相對(duì)于PCR擴(kuò)增技術(shù)具有快速、高效、特異的優(yōu)點(diǎn)且無需專用設(shè)備，在臨床和現(xiàn)場(chǎng)快速診斷中應(yīng)用廣泛。主要方法有：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）、滾環(huán)核酸擴(kuò)增（RCA）、核酸序列依賴性擴(kuò)增（NASBA）、鏈替代擴(kuò)增（SDA）和解鏈酶擴(kuò)增（HAD）［48］等。

在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)領(lǐng)域最常用的主要是LAMP技術(shù)，它是由Notomi等發(fā)明的一種等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)［49］?；驹硎轻槍?duì)目標(biāo)DNA的6個(gè)不同區(qū)域設(shè)計(jì)4條不同的引物，依賴鏈置換DNA聚合酶，在恒溫下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，循環(huán)不斷地產(chǎn)生不同長度的DNA片段，反應(yīng)結(jié)果可通過凝膠電泳、焦磷酸鎂沉淀、實(shí)時(shí)比濁法、特定熒光染料等來判斷［24，48］；周杰等［50］建立了DAS-81419-2、FG72等6種轉(zhuǎn)基因大豆的LAMP檢測(cè)方法；Chen等［51］開發(fā)的針對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1的事件特異性檢測(cè)方法中，將鈣黃綠素和錳離子添加至LAMP體系中，可實(shí)現(xiàn)一步可視化檢測(cè)，方法靈敏度達(dá)10-20個(gè)拷貝。

最近的研究顯示，將LAMP技術(shù)與其他技術(shù)結(jié)合是轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的發(fā)展趨勢(shì)。Cheng等［52］將LAMP與DNA酶橫向流動(dòng)檢測(cè)試紙條技術(shù)結(jié)合，用于檢測(cè)復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因大豆DP305423×GTS 40-3-2，該方法具備良好的靈敏度和特異性；Shao等［53］開發(fā)了特殊的毛細(xì)管柱裝置，將LAMP特異引物固定于毛細(xì)管壁的內(nèi)壁后，一次上樣并恒溫?cái)U(kuò)增后，可直接可視化檢測(cè)10個(gè)靶標(biāo)基因的擴(kuò)增結(jié)果，該方法操作簡便、通量高，可用于田間快檢和大規(guī)模轉(zhuǎn)基因篩查工作；Morisset等［54］將NASBA技術(shù)與芯片技術(shù)相結(jié)合，開發(fā)了多重轉(zhuǎn)基因檢測(cè)芯片，該方法的特異性與靈敏度與qPCR方法相當(dāng)，定量檢測(cè)的線性范圍為0.1%-25%，是非常有潛力的高通量檢測(cè)方法。LAMP技術(shù)對(duì)設(shè)備要求低，具有直觀、高效的特點(diǎn)，已經(jīng)成為出入境檢驗(yàn)檢疫等行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的一種指定方法，未來仍需克服假陽性較高、引物設(shè)計(jì)要求高等不足。

1.4 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)（Gene chip）是基于核酸雜交的一項(xiàng)高通量檢測(cè)技術(shù)，利用固體在基質(zhì)表面的上千個(gè)特定探針與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過分析雜交信號(hào)，能夠一次性準(zhǔn)確地對(duì)樣品中不同種類的DNA序列進(jìn)行定性、定量的篩查，已被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)等許多領(lǐng)域。Tengs等［55］設(shè)計(jì)了包含約4萬個(gè)探針的Tilling芯片，涵蓋絕大多數(shù)植物轉(zhuǎn)化用的載體序列，可用于篩查未知轉(zhuǎn)化事件；Turkec等［56］對(duì)3個(gè)轉(zhuǎn)基因大豆和9個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米開發(fā)檢測(cè)芯片，篩選出33個(gè)探針可用于區(qū)分12個(gè)GMO事件，并開發(fā)了一套數(shù)據(jù)算法來實(shí)現(xiàn)最大的檢測(cè)通量和靈敏度?；蛐酒夹g(shù)滿足當(dāng)前轉(zhuǎn)基因高通量、自動(dòng)化檢測(cè)的需求，但由于其成本較高、芯片合成復(fù)雜、背景干擾嚴(yán)重等不足，一定程度影響了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。

2 基于外源蛋白的檢測(cè)技術(shù)

基于外源蛋白的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)是以免疫分析技術(shù)為基礎(chǔ)的對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的外源表達(dá)蛋白進(jìn)行定性和定量檢測(cè)的一種技術(shù)。常見的方法主要包括酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)、Western blot 檢測(cè)技術(shù)和試紙條技術(shù)等。

2.1 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)

酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）通過抗原和抗體的可視免疫反應(yīng)來檢測(cè)和鑒定目標(biāo)蛋白，主要包括雙抗夾心法、直接法、間接法，其中靈敏度最高的雙抗夾心法應(yīng)用最為廣泛［57］。Guertler等［58］利用雙抗體夾心ELISA檢測(cè)法實(shí)現(xiàn)了對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中Cry1Ab蛋白的檢測(cè)，最低檢測(cè)限為0.4 ng/mL，特異性高于實(shí)時(shí)熒光PCR方法。目前，我國對(duì)已獲生產(chǎn)應(yīng)用安全證書的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的衍生品系進(jìn)行安全評(píng)價(jià)檢測(cè)時(shí)，采用ELISA檢測(cè)技術(shù)對(duì)抗蟲棉不同組織部位中Bt蛋白的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，從而對(duì)抗蟲棉品種的抗性能力進(jìn)行科學(xué)評(píng)價(jià)。新近發(fā)展起來的PCR- ELISA技術(shù)，結(jié)合了PCR方法的高效性和ELISA方法的高特異性，在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)領(lǐng)域中極具潛力。利用PCR-ELISA方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆的靈敏度比歐盟用的PCR方法高5-10倍，而且有效的避免了假陽性現(xiàn)象的產(chǎn)生［59］。

2.2 Western blot檢測(cè)技術(shù)

Western blot檢測(cè)技術(shù)本質(zhì)是一種蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移電泳技術(shù)，其原理是將聚丙烯酰胺凝膠上分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，利用抗體反應(yīng)和顯色酶反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中外源蛋白的有效檢測(cè)。Wang等［60］利用Western blot 技術(shù)檢測(cè)到了轉(zhuǎn)基因煙草外源EPSPS 蛋白的表達(dá)；Yates等［61］利用Western blot技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因種子的檢出限能達(dá)到0.25%，深加工產(chǎn)品可達(dá)到1%，靈敏度較高。雖然Western blot技術(shù)操作較為繁瑣，也無法滿足快速高效檢測(cè)需求，但其可以有效地檢測(cè)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中的不可溶蛋白。

2.3 試紙條技術(shù)

試紙條技術(shù)是基于免疫層析的一種快速檢測(cè)技術(shù)，較之ELISA 法更為簡便、快速，可在5-10 min的時(shí)間內(nèi)現(xiàn)場(chǎng)觀測(cè)結(jié)果，在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品大規(guī)?？焖俸Y查檢測(cè)中應(yīng)用廣泛。許多公司針對(duì)不同轉(zhuǎn)基因植物中特異表達(dá)的外源蛋白，開發(fā)出大量特異的免疫層析試紙條，如檢測(cè)孟山都公司轉(zhuǎn)基因Roundup Ready大豆和油菜中CP4-EPSPS蛋白的試紙條、Starlink玉米中Cry9c蛋白的試紙條等［62］。中國農(nóng)科院油料所研制的Cry1Ab/Cry1Ac試紙條，成本為進(jìn)口產(chǎn)品的40%，靈敏度等性能參數(shù)與進(jìn)口試紙條相當(dāng)，是農(nóng)業(yè)部推薦使用的產(chǎn)品之一。由于試紙條技術(shù)具備操作簡便快速、特異性強(qiáng)、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，其發(fā)展和應(yīng)用較為迅速。Santos等［63］研發(fā)了一種可以同時(shí)檢測(cè)Cry1Ac和Cry8Ka5殺蟲蛋白的試紙條，檢出限為0.06 μg，可以很好地區(qū)分抗蟲轉(zhuǎn)基因植物和非轉(zhuǎn)基因植物；Mutoni等［64］用PCR法和試紙條對(duì)肯尼亞市場(chǎng)上的120份玉米樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)基因檢測(cè)，兩種方法結(jié)果一致；張欣等［65］采用試紙條法檢測(cè)水稻樣品，結(jié)果準(zhǔn)確，測(cè)試時(shí)間短于qPCR法，適用于水稻及其產(chǎn)品的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和大規(guī)模初篩；張?jiān)＞龋?6］將PCR技術(shù)與試紙條技術(shù)相結(jié)合建立了一種可視化檢測(cè)轉(zhuǎn)基因黑曲霉的方法，該方法比傳統(tǒng)凝膠電泳法快捷且靈敏度高出10倍以上。隨著試紙條技術(shù)不斷完善，克服假陰性、假陽性和背景色較重的問題，提升靈敏度和實(shí)現(xiàn)多元檢測(cè)，試紙條在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中將發(fā)揮更重要的作用。

3 展望

綜上所述，基于外源核酸的檢測(cè)技術(shù)準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性好、操作簡便，但轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中的多糖、蛋白等雜質(zhì)會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生一定的干擾，而且DNA的提取質(zhì)量對(duì)結(jié)果影響較大；基于外源蛋白的檢測(cè)技術(shù)靈敏度高、結(jié)果可靠、重復(fù)性好，但受后期加工環(huán)節(jié)的影響，而且外源蛋白在不同部位和不同時(shí)期的不同表達(dá)量會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響。在實(shí)際檢測(cè)過程中，并非任何一種檢測(cè)方法對(duì)某種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)都行之有效，每種方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)和適用范圍，選擇檢測(cè)方法時(shí)應(yīng)根據(jù)檢測(cè)的需要并結(jié)合轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的類型和特點(diǎn)，選擇最有效的方法或技術(shù)組合［67］。隨著商業(yè)化轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物品系的快速增長，以及轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)與監(jiān)管需求，轉(zhuǎn)基因檢測(cè)日趨多樣化、復(fù)雜化。除以上介紹的方法之外，電化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)、色譜技術(shù)、近紅外光譜檢測(cè)技術(shù)、生物傳感器技術(shù)、生物分子互作技術(shù)以及基于一些成熟技術(shù)建立起來的試劑盒技術(shù)、內(nèi)標(biāo)基因種屬特異性檢測(cè)技術(shù)等在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的實(shí)際檢測(cè)中都有所應(yīng)用。

隨著基因編輯和RNAi等轉(zhuǎn)基因新技術(shù)的應(yīng)用與推廣，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品呈現(xiàn)出多樣化發(fā)展的趨勢(shì)。加之當(dāng)前可用的轉(zhuǎn)基因分子特征信息十分有限，相關(guān)數(shù)據(jù)庫也并不完善，現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)體系正面臨著巨大挑戰(zhàn)。建立快速、精準(zhǔn)、低成本、高通量的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)與方法已成當(dāng)務(wù)之急。通過轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)科技項(xiàng)目的實(shí)施，我國轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)發(fā)展將越來越快。大力發(fā)展符合國情的、科學(xué)可靠的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)，掌握核心技術(shù)，搶占領(lǐng)域高地，不僅關(guān)乎國家利益，而且對(duì)推動(dòng)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)發(fā)展及維護(hù)環(huán)境和食品安全方面都具有十分重要的意義。

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