袁向芬 呂繼洲 吳紹強 王巧黎 趙宏

（1. 中國檢驗檢疫科學(xué)研究院動物檢疫研究所，北京 100176；2. 青島市中心醫(yī)院，青島 266042）

2000年，日本學(xué)者Notomi發(fā)明了一種新型等溫核酸擴增方法——環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（Loopmediated isothermal amplification，LAMP）［1］， 經(jīng) 近20年研究積累，該方法靈敏度高、特異性強、易于操作等優(yōu)點已被廣泛接受，LAMP亦被認(rèn)為是一種可有效規(guī)避PCR檢測對儀器設(shè)備的依賴、行之有效的現(xiàn)場快速篩查技術(shù)，并開始應(yīng)用于病原微生物及物種鑒定、疫病現(xiàn)場檢測、臨床診療等領(lǐng)域。本文結(jié)合LAMP技術(shù)優(yōu)勢，對其發(fā)展及應(yīng)用現(xiàn)狀進行了綜述，并對其目前存在的不足、技術(shù)群的發(fā)展需求和趨勢進行了分析，希望有助于LAMP技術(shù)的進一步推廣應(yīng)用。菜豆花葉壞死病毒［12］等植物病原。此外，LAMP技術(shù)還被應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因大豆［13］等的品系研究，以及中藥人參成分鑒定［14］、奶牛胚胎早期性別鑒定［15］等領(lǐng)域。

1 LAMP技術(shù)檢測及應(yīng)用現(xiàn)狀

LAMP方法與常規(guī)的核酸擴增法相比具備其獨特優(yōu)點：恒溫擴增、高效快速、靈敏度高、特異性強、結(jié)果判定簡單，使得LAMP技術(shù)成為繼PCR技術(shù)后受研究人員青睞的核酸檢測方法之一。

LAMP在細(xì)菌檢測方面的研究和應(yīng)用較廣泛，目前本技術(shù)已應(yīng)用于結(jié)核桿菌、肺炎鏈球菌、副溶血性弧菌等多種常見致病菌的檢測，主要原因在于：一方面，細(xì)菌的核酸抽提簡單易行，可采用直接煮沸法等方式進行；同時，細(xì)菌基因組較為保守，借助LAMP的高效擴增優(yōu)勢，有助于疫病的快速確診。如Ahmad等［2］建立了一種檢測水中大腸桿菌及檢測水中腸球菌的LAMP檢測方法；Dou等［3］建立了一種檢測腦膜炎的多重芯片LAMP檢測法；Lee等［4］建立了一種檢測血液及乳液中細(xì)菌的多重LAMP檢測方法，這些方法均無需復(fù)雜的核酸抽提程序，待檢樣品可直接加入LAMP反應(yīng)試劑中進行擴增，整個檢測過程快速、簡單，非常適用于臨床。相比而言，應(yīng)用LAMP技術(shù)對病毒進行檢測目前多局限于實驗室內(nèi)研究，缺乏現(xiàn)場應(yīng)用的主要原因為樣品中病毒含量相對較低且基因易于突變、RNA病毒還極不穩(wěn)定，現(xiàn)場核酸抽提的得率及純度難以滿足病毒基因檢測需求，但這并不影響LAMP成為PCR技術(shù)之后的一種新型的病毒實驗室診斷技術(shù)，相關(guān)的研究涉及了流感病毒［5］、埃博拉病毒［6］、西尼羅河病毒［7］等人類易感病原，口蹄疫病毒［8］、犬細(xì)小病毒［9］、非洲豬瘟病毒［10］等動物病原和玉米萎黃病毒［11］、

2 LAMP技術(shù)群研究進展

2.1 核酸物質(zhì)的快速抽提

核酸抽提是基因檢測的基礎(chǔ)，是分子生物學(xué)最關(guān)鍵的技術(shù)工具之一［16］。LAMP在疫病快速初篩領(lǐng)域的發(fā)展，要求配套建立簡單快速且適用于臨床環(huán)境的提取方法。目前，常用的核酸提取方法包括酚-氯仿法、異硫氰酸鹽裂解法及離心柱提取法等，多為商品化試劑盒，成本較高，且操作流程繁冗、耗時或需要專業(yè)的實驗室設(shè)備，并不適合現(xiàn)場檢測。Camp等［17］建立了檢測兩種正布尼亞病毒的LAMP檢測方法，為提高方法的臨床適用性，嘗試跳過核酸純化步驟直接進行LAMP擴增，結(jié)果靈敏度下降了100倍，不能滿足高靈敏檢測需求。馮娜等［18］將磁珠法核酸提取與LAMP技術(shù)結(jié)合，建立了鼠疫桿菌快速檢測方法，其通過“裂解-吸附-洗滌-洗脫”四步驟進行核酸提取，省卻了離心機，操作更為簡單快速。近年來，借助磁分離原理，一些半自動化、自動化核酸提取儀被陸續(xù)開發(fā)出來，如半自動核酸提取儀（MCB1200，美國思博明）、移液法核酸提取儀（Magtration@12GC，日本PSS）以及高通量磁珠純化儀（KingFisher Flex 96，美國賽默飛）等，實現(xiàn)了核酸提取的自動化、高通量化，節(jié)省了人力、時間，已被廣泛應(yīng)于專業(yè)分析實驗室中。Liu等［19］借助FTA（Flinders technology associates）卡，建立了一種快速檢測HIV病毒的RT-LAMP檢測方法，靈敏度可達(dá)102個病毒顆粒，F(xiàn)TA卡可快速破裂樣品細(xì)胞，緊密結(jié)合其釋放的核酸物質(zhì)，通過洗滌可有效去除樣品中抑制因子，并不會對LAMP擴增效率產(chǎn)生明顯影響，目前亦有相關(guān)研究將其應(yīng)用于分枝桿菌、鼠疫桿菌、瘧原蟲及真菌等［20-22］LAMP檢測方法中。2007年，日本榮研公司（Eiken Chemical）建立了一種簡單快速的結(jié)核分枝桿菌LAMP檢測技術(shù)［23］，該技術(shù)采用了管式DNA快速提取法。待檢樣本經(jīng)過裂解管內(nèi)的加熱裂解、吸附管內(nèi)的核酸吸附、LAMP管內(nèi)的擴增及紫外燈下判定等過程。所需的裂解液、反應(yīng)液等均預(yù)置于各管中，無需額外添加，通過手動擠壓實現(xiàn)液體在各管間的傳遞，大大減少了污染的可能。日本榮研公司配套研發(fā)了專門的一體化儀器，集成了加熱裂解、等溫擴增及紫外觀察等模塊，使檢測更加方便快捷。WHO已正式推薦該方法用于肺結(jié)核的臨床診斷中。

然而，直接擴增法會導(dǎo)致靈敏度的下降；磁珠法操作較復(fù)雜且提取成本較高；FTA卡僅適用于血液、口腔細(xì)胞等細(xì)胞水平的樣品，且提取RNA僅可保存7周，日本榮研公司研發(fā)的快速核酸提取技術(shù)也僅局限于唾液、血清、鼻咽拭子等液體樣品的DNA快速萃取及檢測。因此，探索一種簡單、快速、經(jīng)濟、適用于現(xiàn)場及多種樣品類型、可同時用于DNA及RNA抽提的核酸提取技術(shù)平臺是目前需求所在。筆者建議從以下幾方面進行改進：一是配套快速裂解液的研發(fā)，目前常用的裂解液多種多樣，包括胍鹽裂解液、堿性裂解液、酚裂解液等，這些裂解液均可實現(xiàn)核酸物質(zhì)與蛋白質(zhì)的迅速分離，有研究對幾種常見核酸裂解液進行了比對，結(jié)果顯示胍鹽法及酚氯仿抽提的效果最佳［24］。二是現(xiàn)場快速核酸抽提技術(shù)的研發(fā)，常規(guī)的核酸抽提步驟為裂解、分離、洗滌及洗脫等步驟，多是借助離心機或者磁珠吸附進行的，難以為現(xiàn)場核酸提取使用。亟需研發(fā)便攜的現(xiàn)場核酸抽提方法。

2.2 LAMP檢測體系的優(yōu)化完善

在口岸檢疫、動物疫病監(jiān)測等工作中，針對單一指標(biāo)的檢測方法并不利于快速通關(guān)或疫情預(yù)警，而同時對多重靶標(biāo)進行檢測分析可有效提升工作效率、降低成本、減少工作量，是一種理想的檢測手段，因此，多重檢測將是LAMP發(fā)展的必然趨勢［25］。然而，有研究顯示BST聚合酶具非特異擴增、線性DNA 片段多聚體化等特殊活性［26-28］，使LAMP易出現(xiàn)產(chǎn)物量大、分子量高或仍呈現(xiàn)梯形分布的非特異擴增產(chǎn)物［29-30］，導(dǎo)致反應(yīng)產(chǎn)物眾多，影響檢測特異性。王彩霞等［31］通過引物設(shè)計及篩選，優(yōu)化建立了一種同時檢測貝類派琴蟲和包納米蟲的雙重LAMP方法，在設(shè)計的兩套LAMP引物中引入限制性內(nèi)切酶位點，通過酶切實現(xiàn)了2 種寄生蟲的鑒別診斷。

分析表明，在60-65℃ LAMP反應(yīng)條件下，核苷酸鏈處于解鏈和退火的動態(tài)平衡狀態(tài)，無需外引物的置換作用亦可啟動引物退火。為避免引物數(shù)量過多產(chǎn)生的抑制作用，研究者將擴增效率較高的一組或兩組引物的外引物去除，獲得了較好的擴增結(jié)果。石素婷［32］針對幾種水生動物疫病建立了一系列LAMP檢測方法，在此基礎(chǔ)上去除外引物，組建了錦鯉皰疹病毒、鯉春病毒雙重LAMP檢測法及流行性造血器官壞死病毒、傳染性造血器官壞死病毒、病毒性出血性敗血癥病毒三重LAMP檢測法。

Kasahara等［33］發(fā)現(xiàn)在相同條件下，與單重擴增相比，多重擴增時引物擴增速度明顯變慢，推測為引物間的相互抑制作用導(dǎo)致。目前，NEB等生物公司已陸續(xù)開發(fā)出Bst 2.0、Bst 3.0等通過電腦設(shè)計合成的新型Bst聚合酶，相比野生型Bst聚合酶或其大片段，具更強擴增力，有研究表明Bst2.0或Bst2.0 WarmStart DNA聚合酶擴增速度比野生型快50%左右［34］，可大大縮短反應(yīng)時間，并且可在一定擴增抑制劑存在情況下或不純樣本中進行擴增，使得LAMP技術(shù)更適用于現(xiàn)場快檢。

隨著微流控技術(shù)的發(fā)展，可通過建立微型芯片，配置多個單獨的反應(yīng)池來完成多重體系的組建。博奧晶典生物技術(shù)有限公司研制出一種圓形的碟式芯片［35］，可實現(xiàn)對同一樣品中24個不同基因靶標(biāo)的同時檢測，該方法大大降低了時間、人員及試劑耗材投入；24個微室內(nèi)的反應(yīng)單獨進行，不會造成相互干擾；無需進行開管操作，不會產(chǎn)生核酸物質(zhì)污染。類似的設(shè)計理念同樣被用來檢測腦膜炎［3］、腸道致病菌［36］等。

2.3 LAMP結(jié)果的判定

LAMP擴增結(jié)果的判定途徑多樣，除常規(guī)電泳法外，還可借助沉淀法、染料法進行，其中，沉淀法利用了DNA合成過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀作為反應(yīng)標(biāo)識物，而染料法則利用了染料與核酸的螯合作用，兩種方法均可實現(xiàn)反應(yīng)結(jié)果的可視化判定。

基于防污染的考慮，閉管的判定方式將更適合現(xiàn)場診斷。雖然沉淀法和染料法均可進行肉眼觀察，但存在個體差異導(dǎo)致的視覺誤差，如何放大陰陽性之間差異，是準(zhǔn)確判定的前提。染料法有自然光下和紫外光下判定兩種方式，紫外光下，陽性會發(fā)射明顯熒光，陰性不發(fā)光，大大增加了陰陽性差異，判定更快、更準(zhǔn)，紫外法利用一盞手持紫外燈即可實現(xiàn)。另外，袁向芬［37］等對LAMP常用的幾種染料進行了比較篩選，發(fā)現(xiàn)目前常用的染料如鈣黃綠素等對LAMP反應(yīng)具有一定抑制作用，作者篩選到一種核酸染料Dye63，抑制作用更小，并通過多功能酶標(biāo)儀對反應(yīng)結(jié)果熒光強度進行了讀取，陰陽性熒光強度存在顯著差異，可利用終點法進行準(zhǔn)確判定。

橫向流動裝置（Lateral flow device，LFD），即免疫層析試紙條技術(shù)亦開始應(yīng)用于現(xiàn)場可視化快速檢測研究中，該方法所使用的膠體金材料對反應(yīng)結(jié)果具放大作用，使結(jié)果觀察更加直觀。Nimitphak等［38］建立了檢測對蝦肝胰腺細(xì)小病毒的LAMP-LFD法，可在75 min內(nèi)完成檢測。研究顯示，LAMP-LFD方法簡單、快速，敏感性接近熒光PCR方法，是一種非常具有潛力的現(xiàn)場診斷技術(shù)。LFD法的不足在于無法有效區(qū)分非特異性擴增，且需開管檢測，易導(dǎo)致核酸氣溶膠污染。

可見，閉管判定的目視法似乎更適用于臨床初篩，目前，篩選抑制作用更小的核酸染料，設(shè)計可準(zhǔn)確獲取熒光數(shù)據(jù)的便攜儀器是該領(lǐng)域的發(fā)展方向之一。

2.4 LAMP假陽性結(jié)果的規(guī)避

LAMP檢測易產(chǎn)生氣溶膠污染導(dǎo)致假陽性結(jié)果的問題為其應(yīng)用中的主要阻礙，也是眾多研究者操作過程中遇到最棘手的問題。實驗室分區(qū)操作是大家普遍使用的應(yīng)對方式，但“治標(biāo)不治本”，如何從根本上控制污染的產(chǎn)生，是解決這一問題的關(guān)鍵。

劉威等［39］使用了一種封閉劑，于反應(yīng)前加入反應(yīng)液中，反應(yīng)過程中封閉劑由固態(tài)熔化為液態(tài)并封閉于液面之上，減少了氣溶膠揮發(fā)。Wang等［40］在引物5′端標(biāo)記了自避分子識別系統(tǒng)（Self-avoiding molecular recognition systems，SAMRS），可杜絕大多數(shù)由引物引起的非特異性擴增，并利用熱敏性尿嘧啶-DNA糖苷酶（AUDG）將預(yù)混液中包含的遺留性污染模板去除，建立的錐蟲SAMRS- AUDG-LAMP檢測法反應(yīng)時長較標(biāo)準(zhǔn)LAMP延長30 min，但并未對反應(yīng)靈敏度造成影響。

以上方法雖為假陽性問題的解決提供了寶貴經(jīng)驗，但封閉劑的使用原則上相當(dāng)于閉管操作，限制了對反應(yīng)液的進一步分析；而SAMRS- AUDG-LAMP檢測法增加了引物設(shè)計及篩選的難度，且一定程度上降低了反應(yīng)速度。NEB產(chǎn)品說明書中介紹其生產(chǎn)的Bst 2.0 DNA聚合酶完全兼容AUDG法，并不會對擴增速度產(chǎn)生影響，筆者建議可借此來降低交叉污染發(fā)生幾率。

2.5 LAMP結(jié)果的確診

目前，LAMP結(jié)果的確診通常借助限制性內(nèi)切酶鑒定法進行，可在擴增子內(nèi)部尋找其特異性酶切位點，或在LAMP內(nèi)引物內(nèi)部引入外源性酶切位點，以實現(xiàn)結(jié)果的實驗室確診。但酶切鑒定需對反應(yīng)液進行開蓋操作，這會大大增加氣溶膠污染幾率，另外，該操作需一定實驗室環(huán)境，在臨床檢測工作中并不適用?；谶@一點，Tone等［41］建立了利用溶解曲線法進行四種病原分析鑒別的LAMP擴增法。其原理在于通過溶解曲線的形狀及峰值對反應(yīng)產(chǎn)物進行特異性判定。理論上，相同的擴增產(chǎn)物應(yīng)該具備相同的溶解曲線，序列上微小的不同亦會表現(xiàn)在溶解曲線形狀或峰值的不同上，由此即可確定是否存在非特異性擴增。當(dāng)然，該方法的實際應(yīng)用亦須配合現(xiàn)場化的便攜儀器進行。

2.6 LAMP現(xiàn)場診斷一體化平臺

LAMP技術(shù)本身及其周邊技術(shù)群目前已有了長足發(fā)展，然而相關(guān)研究廣而雜，各成一家，如何將其有機結(jié)合，構(gòu)建一體化基因快速篩查平臺，實現(xiàn)監(jiān)測數(shù)據(jù)及成果共享并對實際工作產(chǎn)生指導(dǎo)作用，這將成為LAMP推廣應(yīng)用最關(guān)鍵的一步。

一體化設(shè)計要求我們構(gòu)建核酸快速抽提、LAMP快速擴增、結(jié)果準(zhǔn)確判定及數(shù)據(jù)實時上傳的LAMP快篩平臺，實現(xiàn)LAMP診斷系統(tǒng)化、便攜化、科技化。已有研究成功將LAMP擴增、電泳及后續(xù)分析整合在芯片上［42］，運用該芯片可在15 min內(nèi)完成濃度為23 fg/μL的核酸樣品的LAMP擴增、電泳及判定，其不足在于缺少核酸快速抽提的解決方案，同時存在氣溶膠污染風(fēng)險；另外，本文涉及的將LAMP技術(shù)與各種新技術(shù)結(jié)合，如防污染法、橫向流動試紙條裝置、新型核酸染料的研發(fā)、便攜儀器的開發(fā)等，這些技術(shù)的綜合應(yīng)用方能“互補其短，實現(xiàn)共贏”；同時，我們應(yīng)意識到基因現(xiàn)場快速檢測的目的在于指導(dǎo)進一步工作，因此數(shù)據(jù)匯總分析及實時上傳也將成為一體化設(shè)計的一部分，要求儀器同時具備數(shù)據(jù)遠(yuǎn)程傳輸終端功能，目前，這種終端機的研究與應(yīng)用也較為廣泛，如用于氣候、水質(zhì)、疫情的監(jiān)測及數(shù)據(jù)匯總等，LAMP現(xiàn)場快速篩查結(jié)果亦可通過這種手持終端機進行實時上傳，實現(xiàn)對大數(shù)據(jù)的綜合匯總分析，并準(zhǔn)確指導(dǎo)一系列相關(guān)工作。

一體化平臺的構(gòu)建將為臨床基因檢測工作提供一個高效運轉(zhuǎn)機制，大大節(jié)省人員、時間及物質(zhì)成本，具有長遠(yuǎn)的經(jīng)濟及社會效益。

3 展望

本文將LAMP技術(shù)定位于一種現(xiàn)場基因快檢技術(shù)，是因其具備高效、快速、操作簡單等特點，目前，涉及基因現(xiàn)場快速診斷的監(jiān)測技術(shù)平臺仍不完善，是我們亟須解決的一個難題，但可以確定的是LAMP技術(shù)等新型核酸擴增技術(shù)將成為這種基因快速初篩平臺的關(guān)鍵技術(shù)。

縱觀LAMP技術(shù)發(fā)明至今，相關(guān)檢測技術(shù)已經(jīng)涉及醫(yī)藥、環(huán)境、衛(wèi)生等方方面面，其不斷發(fā)展的過程伴隨著不斷與各種新技術(shù)的組合優(yōu)化過程，免疫層析試紙條技術(shù)、微流控技術(shù)及測序技術(shù)等目前較熱的新型技術(shù)均可與LAMP技術(shù)相輔相成應(yīng)用于臨床基因診斷中，它的下一步發(fā)展仍需要研究者不斷的探索與創(chuàng)新，真正建立現(xiàn)場基因診斷一體化平臺，使其應(yīng)用不再受時間、地點、操作人員等條件的限制，任重而道遠(yuǎn)！