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        miRNA29靶基因CCND2和CDK6在宮頸癌中的表達(dá)研究

        2018-03-31 06:07:46沈樹娜宮本麗
        中國(guó)婦幼健康研究 2018年1期
        關(guān)鍵詞:意義差異

        沈樹娜,王 輝,宮本麗

        (內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,內(nèi)蒙古 包頭 014010)

        宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤,細(xì)胞周期的失控與腫瘤的發(fā)生有著明顯的相關(guān)性[1-2]。miRNA是廣泛存在于真核生物體中的一組內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA,其中微小核糖核酸29(microRNA,miRNA29)在多種惡性腫瘤中低表達(dá),其通過靶向細(xì)胞周期素D2重組蛋白(recombinant cyclin D2,CCND2)和周期蛋白依賴性激酶6(cyclin-dependent kinases,CDK6)參與細(xì)胞周期的調(diào)控和宮頸癌的發(fā)生發(fā)展[3-4],本實(shí)驗(yàn)采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測(cè)宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中CCND2、CDK6表達(dá)情況并分析了二者在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的相互作用。

        1材料與方法

        1.1材料

        收集2015年6月至2017年1月內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦科宮頸癌手術(shù)切除標(biāo)本20例,因?qū)m頸上皮內(nèi)瘤變子宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)行宮頸錐切標(biāo)本24例,因子宮肌瘤行全子宮切除標(biāo)本 20例,所有病例均經(jīng)病理確診。宮頸癌(病理結(jié)果均為宮頸鱗狀細(xì)胞癌)患者術(shù)前均未接受放化療,按年齡可分為:≥40歲16例,<40歲4例;按臨床分期,Ⅰ期6例,Ⅱ期14例;按有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可分為:有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者2例,無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例;按病理組織學(xué)分級(jí)可分為:中、低分化9例,高分化11例。

        1.2研究方法

        實(shí)驗(yàn)中新鮮標(biāo)本均經(jīng)病理醫(yī)師取材,收取組織在術(shù)中離體后馬上收取,立即予生理鹽水漂洗去除血跡,置于組織涼存管,立即放入液氮速凍,然后移至冰箱保存直至使用。采用RT-PCR 檢測(cè)宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織、CIN組織、正常宮頸組織中CCND2、CDK6的信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA)水平。

        1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        采用Sigma State軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,多組計(jì)量資料比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn),兩組比較采用Mann-Whitney 檢驗(yàn)。CCND2和CDK6相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。采用雙側(cè)檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05,P<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2結(jié)果

        2.1 miRNA29靶基因CCND2在三組中的表達(dá)

        miRNA29靶基因CCND2在正常宮頸組織、CIN組織和宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中的相對(duì)表達(dá)量平均值為0.00140859、0.00204650、0.01702534。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,CCND2在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平與CIN組織相比顯著上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=60.00,P<0.05),在正常宮頸組織與CIN組織的表達(dá)水平相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=184.00,P>0.05),在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織的表達(dá)水平與宮頸正常上皮組織相比顯著上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=16.00,P<0.05)。結(jié)果見表1和圖1。

        表1CCND2在正常宮頸組織、CIN組織、宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)

        Table 1Expressions of CCND2 in normal cervical tissues, CIN tissues and tissue of cervical squamous cell carcinoma

        編號(hào)分組例數(shù)(n)CCND2平均值HP1UP21宮頸鱗狀細(xì)胞癌組200.0170253460.00<0.05?2CIN組240.0020465029.27<0.05184.00>0.05??3正常宮頸組200.0014085916.00<0.05???

        注:P1為三組間比較,P2為兩組間比較;*為1、2組比較,**為2、3組比較,***為1、3組比較。

        2.2 miRNA29靶基因CDK6在三組中的表達(dá)

        miRNA29靶基因CDK6在正常宮頸組織、CIN組織和宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中的相對(duì)表達(dá)量平均值為0.00104340、0.00028625、0.00066675,CDK6在正常宮頸組織、CIN組織、宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(H=2.76,P>0.05)。結(jié)果見表2,圖1。

        表2CDK6在正常宮頸組織、CIN組織、宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)

        Table 2Expressions of CDK6 in normal cervical tissues, CIN tissues and tissue of cervical squamous cell carcinoma

        編號(hào)分組例數(shù)(n)CDK6平均值HP1宮頸鱗狀細(xì)胞癌組200.000666752CIN組240.000286252.76>0.053正常宮頸組200.00104340

        圖1宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中CCND2、CDK6 PCR產(chǎn)物電泳圖

        Fig.1Electrophoretogram of PCR production of CCND2 and CDK6 in cervical squamous cell carcinoma tissue

        2.3 miRNA29靶基因CCND2和CDK6在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中的相關(guān)性

        采用Spearman相關(guān)分析分別結(jié)果顯示:在CIN組織中,CCND2與CDK6表達(dá)呈正相關(guān),結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.58,P<0.05),宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中CCND2和CDK6相關(guān)性分析,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

        2.4 miRNA29調(diào)控的CCND2在宮頸癌組織不同臨床病理特征方面比較

        進(jìn)一步分析宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中CCND2表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)CCND2表達(dá)與宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者的病理分化程度方面的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) ;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面因分布不均而無(wú)法比較。而在FIGO分期、年齡方面的比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05) ,見表3。

        表3宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中CCND2的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

        Table 3Relationship between the expression of CCND2 and clinicopathological features incervical squamous cell carcinoma tissue

        臨床病理特征例數(shù)(n)CCND2平均值UP年齡(歲) ≥40140.0195724839.00>0.05 <4060.01108203淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 陽(yáng)性20.02367749-- 陰性180.01628622FIGO分期?、?0.0100217423.00>0.05?、?40.02002689組織分化程度 高分化110.0074172923.00<0.05 中、低分化90.028768521

        2.5 miRNA29靶基因CCND2在CIN組織中的表達(dá)

        CIN組分為兩組:CINⅠ/Ⅱ組、CINⅢ組。結(jié)果顯示,CCND2在CINⅢ組中的表達(dá)明顯高于CINⅠ/Ⅱ組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表4。

        表4CCND2在CIN組織中的表達(dá)

        Table 4Expression of CCND2 in CIN tissue

        組別例數(shù)(n)CCND2平均值UPCINⅠ/Ⅱ130.001176324.00<0.05CINⅢ110.00327582

        3 討論

        3.1miRNA29與惡性腫瘤

        miRNA29是miRNA中的成員之一,在多種癌癥中異常表達(dá),如乳腺癌、胃癌、宮頸癌等。miRNA29通過靶向CCND2參與細(xì)胞周期的調(diào)控,抑制宮頸癌的發(fā)生,宮頸癌組織中CDK6是miRNA29是靶基因,通過調(diào)控細(xì)胞周期參與宮頸癌的發(fā)生。

        3.2 CCND2與宮頸腫瘤

        CCND2是D型細(xì)胞周期蛋白的成員,其在細(xì)胞周期調(diào)節(jié),分化和惡性轉(zhuǎn)化中起關(guān)鍵作用[4]。鄒冬玲等[5]發(fā)現(xiàn)CCND2在宮頸癌組織中表達(dá)上調(diào),且發(fā)現(xiàn)miRNA29通過靶向CCND2參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果表明,與正常宮頸組織、CIN組織相比,宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中CCND2的表達(dá)水平上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且與病理分級(jí)有關(guān);在正常宮頸組織和CIN組織中CCND2表達(dá)水平比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而在CIN中的CINⅠ/Ⅱ組、CINⅢ組中的表達(dá)存在差異,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明miRNA29靶基因CCND2在早期宮頸病變中(CINⅠ/Ⅱ組)無(wú)顯著異常表達(dá),隨著宮頸病變的進(jìn)展發(fā)揮作用,可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng),由于病理分級(jí)是惡性腫瘤預(yù)后的重要指標(biāo),因此CCND2在判斷宮頸癌的預(yù)后評(píng)估中具有較為重要的臨床意義。

        數(shù)學(xué)相比其他學(xué)科,有著一定的抽象性和邏輯性,這就對(duì)學(xué)生的想象力和接受能力有著比較高的要求,這就導(dǎo)致學(xué)生對(duì)各種新事物的認(rèn)知產(chǎn)生了一定的阻礙。通過將微課融入到初中數(shù)學(xué)課堂之上,就可以將數(shù)學(xué)比較抽象的知識(shí)轉(zhuǎn)變得更加形象具體,特別是各種數(shù)學(xué)原理,依靠微課可以有效地對(duì)學(xué)生進(jìn)行展示,幫助學(xué)生更快、更好地掌握其中的知識(shí),不僅可以切實(shí)提升數(shù)學(xué)課堂教學(xué)效率,還可以使課堂教學(xué)內(nèi)容更加豐富,進(jìn)一步吸引學(xué)生的注意力。

        3.3 CDK6與宮頸腫瘤

        CDK6是CDK家族中的一員,在絲裂原誘導(dǎo)下,與細(xì)胞周期蛋白 D 結(jié)合,參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)。目前已發(fā)現(xiàn),多種腫瘤存在CDK6 基因擴(kuò)增、過表達(dá)或細(xì)胞周期抑制因子缺乏、突變導(dǎo)致的 CDK6活性增強(qiáng)[6]。miRNA29可能是與HPV致癌過程關(guān)系最為密切的miRNA,可能通過細(xì)胞周期等生物學(xué)功能參與HPV相關(guān)的宮頸癌發(fā)生過程,提示miRNA29可能是宮頸鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)的抑癌miRNA。王輝等[7]研究通過免疫組化發(fā)現(xiàn)CDK6的蛋白水平在宮頸癌組織中的表達(dá)明顯上調(diào)。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在正常宮頸組織、CIN組織、宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,與文獻(xiàn)報(bào)道不一致。該結(jié)果的出現(xiàn)可能因?yàn)镃DK6僅是較大細(xì)胞周期、信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的一部分,且本研究存在樣本量不足等缺陷,因而需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量及定量測(cè)試蛋白水平以確定miRNA29靶基因CDK6在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

        3.4 CCND2和CDK6在宮頸腫瘤中的相關(guān)性

        本研究通過RT-PCR測(cè)試CCND2和CDK6在宮頸癌已經(jīng)CIN組織中的表達(dá),并通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析其相關(guān)性。結(jié)果示CCND2和CDK6的表達(dá)水平在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中無(wú)相關(guān)性,而在CIN組織中存在正相關(guān),說(shuō)明miRNA29靶基因CCND2和CDK6在CIN組織中可能起協(xié)同作用,為進(jìn)一步探索miRNA29在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制,本研究下一步可在大樣本量的前提下繼續(xù)研究檢測(cè),隨著宮頸癌的發(fā)生發(fā)展,研究miRNA29靶基因CCND2及CDK6的關(guān)系,以進(jìn)一步探索miRNA29在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制,可為miRNA29可成為宮頸癌診斷和治療的一個(gè)新靶點(diǎn)提供一定的理論依據(jù)。

        [參考文獻(xiàn)]

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        [3]朱紅琴.周期蛋白依賴性激酶6與腫瘤和細(xì)胞分化[J].生命的化學(xué),2009,28(1):52-55.

        [5] 鄒冬玲,王冬,周琦.微RNA-29b通過調(diào)控cyclin D2表達(dá)參與宮頸癌發(fā)生的機(jī)制研究[J]. 腫瘤,2014,34(12):1090-1096.

        [6]Handschick K, Beuerlein K, Jurida L,etal. Cyclin-dependent kinase 6 is a chromatin-bound cofactor for NF-κB-dependent gene expression[J]. Mol Cell, 2014, 53(2):193-208.

        [7]王輝,沈樹娜,王俊飛.宮頸癌組織中CDK6的表達(dá)及臨床意義[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2013,23(34):60-62.

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