王艷華，覃娜，魯仕琦

三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)系，湖北 宜昌 443002

骨肉瘤是20歲以下青少年最常見的惡性實體腫瘤，起源于骨間質(zhì)組織，具有高度惡性、強力侵犯和早期肺轉(zhuǎn)移的特點[1-2]。骨肉瘤的臨床治療遠不理想，雖然隨著三聯(lián)抗癌治療策略的快速發(fā)展，患者的總生存率提高了20% ～30% ，但截肢術(shù)后5年存活率僅5% ～15%(3)。因此，尋找更有效的治療策略是當(dāng)前骨肉瘤防治研究的重點。納米粒子是指有一維尺寸處于1～100 nm量級的小粒子，借助其納米尺寸效應(yīng)，它們可通過高通透性的腫瘤血管，富集于腫瘤內(nèi)，即具有高通透性和滯留效應(yīng)（enhanced permeability and retention effect，EPR效應(yīng)），抑制其生長和發(fā)展[4-5]。除了自身具有抗腫瘤作用外，一些納米粒子還可作為抗腫瘤藥物載體，加載多種抗腫瘤藥物，靶向投遞于腫瘤組織內(nèi)，協(xié)同增強抗腫瘤效應(yīng)[6-10]。本文綜述近年來與骨肉瘤治療密切相關(guān)的納米粒子的研究進展，以期為骨肉瘤的臨床治療提供參考。

1 無機納米粒子

1.1 羥基磷灰石基納米粒子

羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA），是人體骨和牙最主要的無機晶體[11]。納米羥基磷灰石不僅具有良好的骨誘導(dǎo)性能，還具有強的抗腫瘤特性。當(dāng)前圍繞HA納米粒子的研究也取得了一些進展，尤其是作為納米藥物載體應(yīng)用于骨肉瘤的治療研究之中。Wu等制備了載2種藥物（二磷酸鹽和溴結(jié)構(gòu)域蛋白抑制劑）的HA納米粒子，利用K7M2骨肉瘤細胞模型評估了它們的抗癌性能，發(fā)現(xiàn)2種抗癌藥物均使HA結(jié)晶性能降低，尤其是具有高親和性的二磷酸鹽；載溴結(jié)構(gòu)域蛋白抑制劑的HA納米粒子不僅能在骨肉瘤細胞內(nèi)緩慢釋放藥物，還能抑制骨肉瘤細胞向成骨細胞分化，下調(diào)Ezrin的表達，上調(diào)RUNX2的表達[12]。Dhar?man等采用超聲波輻射的方法制備了不同濃度的鉍（Bi）和礦物（M）取代的HA納米粒子Bi-MHAP，觀察了它們對骨肉瘤細胞集落形成及體內(nèi)腫瘤生長的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該納米粒子不僅能促進成骨增殖、增強機械強度，還能抑制腫瘤細胞集落形成和腫瘤組織的生長[13]。Lin等利用簡便的共沉淀法制備了SF/n-HA復(fù)合材料，并將其沉積于鈦合金基片表面，定量分析了SF/n-HA納米復(fù)合材料對骨肉瘤MG63細胞成骨分化的影響。經(jīng)掃描電子顯微鏡（SEM）和MTT測試發(fā)現(xiàn)，該納米復(fù)合物具有較好的生物活性，成骨細胞易于黏附生長。Western印跡表明該納米材料作用后的骨肉瘤細胞堿性磷酸酶（ALP）活力下降，骨鈣素（BGP）和Ⅰ型膠原（ColⅠ）表達量增高，說明SF/n-HA復(fù)合材料具有較好的細胞黏附和成骨分化潛能[14]。以上研究表明，以無機HA為基礎(chǔ)的納米藥物載體，可通過多種方式抑制骨肉瘤生長，有望應(yīng)用于骨肉瘤的治療中。

1.2 金屬基納米粒子

近年來，金屬基納米粒子備受學(xué)者們青睞。如Ag、Ti、Zn、Ce、Au等金屬，由于各自獨特的本征特性，可通過多種方式制備成納米顆粒，用于骨肉瘤的治療。Nayak等介紹了一種利用樹皮（來自孟加拉榕和印度苦楝樹樹種）提取物制備銀納米粒子的綠色合成方法，并評估了它們的抗微生物活性和對抗骨肉瘤增殖效應(yīng)。動態(tài)光散射（DLS）表征分析顯示，由孟加拉榕樹皮合成的納米粒子尺寸約85.95 nm，而由印度苦楝樹樹皮合成的納米粒子尺寸為90.13 nm。UV-Vis測試發(fā)現(xiàn)，2種樹皮提取物合成的納米粒子在426和420 nm波長處均具有吸收峰。經(jīng)場發(fā)射掃描電鏡（FSEM）、X線衍射（XRD）、傅里葉變換紅外光譜（FTIR）、原子力顯微鏡（AFM）表征發(fā)現(xiàn)，所合成的納米粒子為60 nm的球形粒子，具有銀離子特有的衍射峰和功能基團。這些納米粒子能對抗革蘭陰性菌（如大腸桿菌、綠膿桿菌、霍亂弧菌）和陽性菌（如枯草芽孢桿菌）的生長，它們的最小抑菌濃度（MIC）分別為 12.5和 25 μg/mL。所合成的納米銀對骨肉瘤MG63細胞也顯示了劑量依賴式的抗增殖作用，其半數(shù)抑制量（IC50）分別為81.8±2.6（由印度苦楝樹樹皮制備）和75.5±2.4 μg/mL（由孟加拉榕樹樹皮制備）。以上結(jié)果提示，所合成的納米銀粒子可作為廣譜抗腫瘤和抗微生物治療劑使用[15]。Kovacs等利用P53基因在多種腫瘤中功能缺失這一特性，提出了基于激發(fā)P53功能的治療策略的巧妙思路，制備了銀納米粒子，檢測了它們對P53抑癌基因功能缺失的骨肉瘤細胞（U2OS、Saos-2）的胞毒效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用5和35 nm尺寸的檸檬酸包被的銀納米粒子處理后的骨肉瘤細胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能紊亂，細胞凋亡率增高，說明該納米粒子殺滅骨肉瘤細胞不依賴P53功能狀態(tài)，這一特征使得銀納米粒子成為化療策略極具魅力的候選[16]。Iram等報道了一種利用真菌（尖孢鐮刀菌）內(nèi)部轉(zhuǎn)化合成氧化鋱（Tb2O3）納米粒子的綠色制備途徑。把Tb2O3納米粒子與骨肉瘤MG-63和Saos-2細胞共培養(yǎng)，其 IC50為 0.102 μg/mL，而當(dāng)濃度范圍為 0.023～0.373 μg/mL時，骨肉瘤細胞活力呈濃度依賴式降低。形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，納米粒子作用后的骨肉瘤細胞縮小、核固縮、凋亡小體形成。流式細胞術(shù)（FCM）測試和DAPI染色證實，腫瘤細胞呈劑量依賴式的凋亡[17]。Ai等報道了一種具有增強抗骨肉瘤效應(yīng)的葉酸標記TiO2納米粒子，其尺寸隨聚合物的加入而增大，葉酸修飾能提高TiO2的抗骨肉瘤效應(yīng)，源于葉酸能與腫瘤細胞表面高表達的葉酸受體特異性結(jié)合。尤其是FA-TiO2納米粒子能導(dǎo)致骨肉瘤細胞染色質(zhì)濃縮、核固縮和質(zhì)膜出泡，呈現(xiàn)近38% 的凋亡率，進一步檢測發(fā)現(xiàn)細胞周期停滯于G0期（G0細胞比例高達25% ），細胞凋亡相關(guān)蛋白如細胞色素C、caspase-3、聚ADP核糖聚合酶（PARP）的表達明顯增高[18]。Kang等構(gòu)建了基于Au-Ag納米棒的近紅外光響應(yīng)性的藥物載體系統(tǒng)，包被有DNA交聯(lián)的聚合物外殼，利用DNA的互補性原則可發(fā)展聚丙烯酰胺基溶膠凝膠轉(zhuǎn)化體系，以用于包裹抗癌藥物。這種Au-Ag近紅外基納米凝膠也能與它的靶向基團結(jié)合從而功能化，比如核酸適配體特異靶向?qū)δ[瘤細胞的識別。當(dāng)暴露于近紅外光時，該納米棒的光熱效應(yīng)十分明顯，從而可控釋放內(nèi)部藥物。體外研究也顯示，核酸適配體功能化的納米凝膠可作為藥物載體，通過近紅外光的高空間和溫度分辨率效應(yīng)，實現(xiàn)靶向藥物遞送的遠程可控性[19]。Sisub?alan等通過生物學(xué)路徑合成了ZnO和CeO2納米粒子，探索了其在生物醫(yī)學(xué)和藥學(xué)中的利用價值。研究發(fā)現(xiàn)，ZnO和CeO2納米粒子造成骨肉瘤細胞膜損傷，胞內(nèi)出現(xiàn)氧化應(yīng)激，使活性氧簇（ROS）升高，進而細胞凋亡[20]。以上研究說明，金屬基納米粒子可通過多種途徑合成，并經(jīng)不同的作用方式抑制腫瘤細胞的生長。

2 有機納米粒子

2.1 PLGA或PEG高分子有機納米粒子

聚乳酸-羥基乙酸共聚物［poly（lactic-co-gly?colic acid），PLGA］和聚乙二醇（polyethylene gly?col，PEG）均是可生物降解的有機高分子[21-22]。利用PLGA或PEG可制備出多種形貌尺寸的微納米粒子，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。Altindal等通過乳劑-擴散-蒸發(fā)法制備了褪黑素加載的PLGA納米粒子和微米粒子，粒徑分別約為200和3.5 nm。研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素加載的納米粒子包封率為14% ，在生理緩沖液中緩慢釋放褪黑素，到40 d結(jié)束時其釋放量近70% 。骨肉瘤MG63細胞實驗表明，當(dāng)與載有1.7 μg褪黑素的0.05 mg納米粒子共培養(yǎng)時，細胞生長被抑制，說明褪黑素加載的PLGA納米粒子具有胞毒作用，可用于骨肉瘤的化療[23]。Ray等制備了甲氨蝶呤（MTX）加載的PLGA納米粒子（MTX-PLGA），評價了該納米粒子的藥物代謝動力學(xué)、組織分布、動物存活率及抗癌效應(yīng)。結(jié)果表明，該納米粒子對BALB/c裸鼠的半數(shù)致死量（LD50）和抗癌功效均高于純的MTX化療，提示該納米粒子的生物安全性好、抗骨肉瘤性能強[24]。Guan等通過離子交聯(lián)方式制備了100 nm的mPEG-CS納米粒子，并以1∶3的比例將該納米粒子懸液與短發(fā)夾RNA（shRNA）溶液混合，轉(zhuǎn)染骨肉瘤MG63細胞，MTT、RT-PCR和Western印跡檢測，發(fā)現(xiàn)mPEG-CS納米粒子能下調(diào)凋亡抑制蛋白livin和survivin的表達，抑制細胞增殖，促進細胞凋亡[25]。以上研究說明，基于PLGA或PEG的高分子有機納米粒子也可用于骨肉瘤的治療。

2.2 脂質(zhì)基納米粒子

脂質(zhì)基納米粒子在骨肉瘤治療中的研究較多。Yolanda等通過熱乳劑技術(shù)將阿霉素（doxoru?bicin，DOX）和依地福新（edelfosine）包被于脂質(zhì)納米粒子中，觀察了它們對耐藥骨肉瘤細胞生長的協(xié)同抵抗作用，發(fā)現(xiàn)它們能逆轉(zhuǎn)由P-糖蛋白（P-gp）表達上調(diào)所致的骨肉瘤細胞耐藥，且兩藥具有協(xié)同效應(yīng)[26]。Duan等制備了球形的聚合物脂質(zhì)雜化納米粒子（PE-LPN），能加載化療藥物紫杉醇（PTX）和依托泊苷（ETP），可被腫瘤細胞內(nèi)吞，且兩藥聯(lián)合的胞毒作用比單藥更強，骨肉瘤細胞Ki-67陽性表達率降低（＜25% ）[27]。Yu等發(fā)展了表皮生長因子受體（EGFR）交聯(lián)的鹽霉素（salinomycin）加載的聚合物脂質(zhì)雜化納米粒子（EGFR-SNPs），研究了它們靶向腫瘤干細胞（CSCs）和腫瘤細胞的潛能。該納米粒子尺寸約95 nm，對鹽霉素的藥物包封率為63% ，并可持續(xù)緩釋120 h；該納米粒子還能靶向2種腫瘤細胞，產(chǎn)生胞毒作用，減少CD34+CSCs的比例，抑制癌巢形成[28]。Fateme等制備了脂質(zhì)化阿霉素（LDOX），通過分析骨肉瘤細胞攝取和細胞活力變化來優(yōu)化DOX的用藥劑量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，直徑為96 nm的L-DOX呈圓球形，對DOX的包封率高達84% ，并能穩(wěn)定釋放14 d，與細胞共培養(yǎng)時能提高細胞通透性，促進細胞死亡[29]。因此，脂質(zhì)基納米粒子也具有較好的抗骨肉瘤效應(yīng)。

2.3 殼聚糖基納米粒子

殼聚糖又名甲殼素，具有抗菌抗癌等多種生物效應(yīng)[30-32]。圍繞殼聚糖納米粒子的研究也取得了一定的進展。Tian等利用兩親性嵌段共聚物作為藥物載體，制備了粉防己堿加載的CS-PAA納米粒子。該納米粒子呈球形，表面帶正電荷，能抑制骨肉瘤MG63細胞增殖，促進細胞凋亡。Western印跡證實，抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL表達下調(diào)，而促凋亡蛋白Bax表達上調(diào)[33]。Li等探索了泊洛沙姆（poloxamer）修飾的三甲基殼聚糖（TMC）包被甲氨蝶呤用于治療骨肉瘤的可能性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲氨蝶呤加載的聚醚殼聚糖納米粒子（MTCN）能作為納米載體，控制藥物釋放。該納米粒子可被骨肉瘤MG63攝取，在胞漿內(nèi)富集產(chǎn)生胞毒作用，促進細胞凋亡（凋亡率高達48% ）。該研究提示，TMC可作為納米藥物載體用于骨肉瘤的化療[34]。

2.4 肽基納米粒子和納米凝膠

肽基納米粒子和納米凝膠是近年發(fā)展起來的納米材料，對骨肉瘤具有高度選擇性，而對正常細胞低毒。Chang等以兩親性肽C18GR7RGDS作為姜黃素的載體，制備了肽-姜黃素納米粒子，該納米粒子可包封姜黃素于它的疏水核心，提高姜黃素的水溶性，細胞實驗表明該納米粒子可選擇性抑制骨肉瘤MG-63細胞的生長[35]。Li等制備了肽修飾的聚合納米凝膠，用以加載紫草素（shi?konin），實現(xiàn)靶向骨肉瘤細胞的跨膜投遞，細胞和動物實驗表明它能促進骨肉瘤細胞凋亡，并遏制骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移[36]。以上研究說明，肽基納米粒子和納米凝膠均是較好的藥物載體，可實現(xiàn)抗骨肉瘤藥物的靶向投遞。

3 基于納米脈沖刺激的治療策略

納秒脈沖電場（nanosecond pulsed electric field，nsPEF）即納米脈沖刺激（nano-pulse stimula?tion，NPS），具有刺激針對腫瘤細胞的免疫反應(yīng)的潛能。Chen等研究了NPS對晚期肺轉(zhuǎn)移腫瘤模型動物的局部和全身反應(yīng)。他們選擇了12只自發(fā)骨肉瘤的犬和12只荷肝癌的裸鼠，用40 kv/cm強度、1 Hz 500脈沖的電極刺激動物腫瘤組織，觀察動物的生存時間、腫瘤尺寸、血清ALP水平、關(guān)節(jié)囊損傷和肺轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果表明，NPS無熱損傷和關(guān)節(jié)畸變效應(yīng)，能遏制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，延長動物生存時間[37]。因此，局部應(yīng)用NPS是一種無熱治療策略，能減緩骨肉瘤原發(fā)病灶的生長，延長生存期。

4 結(jié)語

骨肉瘤是青少年最常見的惡性骨腫瘤，高發(fā)于四肢長骨干骺端，臨床上易早期復(fù)發(fā)、血行肺轉(zhuǎn)移。其治療一般采用大劑量化療和手術(shù)的綜合治療策略，由于診斷技術(shù)或手術(shù)后預(yù)防措施不完善，最終導(dǎo)致治療不徹底或腫瘤復(fù)發(fā)。納米粒子鑒于其自身結(jié)構(gòu)和功能的特殊性，可作為納米藥物載體，推動骨肉瘤治療研究的進步?；诩{米粒子的骨肉瘤臨床治療前景可望，尤其是作為抗骨肉瘤納米藥物載體的應(yīng)用。然而當(dāng)前人們對上述納米粒子與骨肉瘤相互作用的理論認知和實踐應(yīng)用還存在諸多困難，使其臨床應(yīng)用受到了極大限制，如不同形貌、尺寸的納米粒子對骨肉瘤的生長是否存在形貌、尺寸依賴的抗癌效應(yīng)？不同基質(zhì)納米粒子抵抗骨肉瘤生長的分子機制是否相同？不同種系骨肉瘤細胞對同一納米粒子的刺激反應(yīng)是否存在差異？相信隨著對納米粒子結(jié)構(gòu)-性能關(guān)系規(guī)律研究的深入，以及它們抗骨肉瘤作用分子機理的闡釋，將為納米粒子應(yīng)用于骨肉瘤的精準治療帶來一線希望。