秦莉花，李晟，成邵武，劉林，劉洋，黃娟，龔勝強(qiáng)，程誠，葛金文

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，a.中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.護(hù)理學(xué)院；c.管理與工程信息學(xué)院，湖南長沙市410208

缺血性腦卒中是指腦組織局部血流灌注減少或完全中斷，致使腦組織缺血缺氧，導(dǎo)致局限性腦組織壞死的總稱，占腦卒中60%～80%。腦缺血性疾病在全球已成為發(fā)病率、死亡率、致殘率極高的疾病，并呈持續(xù)增長趨勢[1-2]。腦缺血后發(fā)生一系列聯(lián)級反應(yīng)損傷神經(jīng)細(xì)胞，其中神經(jīng)細(xì)胞凋亡是腦缺血造成神經(jīng)系統(tǒng)損傷的重要機(jī)制[3]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路是近年來神經(jīng)細(xì)胞凋亡的熱點(diǎn)之一[4]，其中細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)與細(xì)胞增殖、凋亡密切相關(guān)，ERK也是神經(jīng)保護(hù)的關(guān)鍵酶之一[5]?？沟蛲鲋委煶蔀橹委熌X缺血的重要方法之一[6]。

腦泰方以補(bǔ)陽還五湯為基礎(chǔ)化裁，臨床已證明具有治療急性腦梗死的作用[7]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)腦泰方能保護(hù)腦缺血再灌注損傷[8]。加味腦泰方在腦泰方基礎(chǔ)上加女貞子、墨旱蓮，具有益氣養(yǎng)陰、化痰活血的功效。本研究用雌性大鼠模型模擬絕經(jīng)后腦缺血，觀察加味腦泰方對模型大鼠細(xì)胞凋亡及ERK1/2、JNK活化的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級雌性Sprague-Dawley大鼠40只，鼠齡8周，體質(zhì)量200～240 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證號SCXK(湘)2014-0011。動(dòng)物飼養(yǎng)及動(dòng)物取材嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理準(zhǔn)則和指南相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要試劑與儀器

兔抗大鼠ERK1/2、JNK、磷酸化ERK(p-ERK 1/2)、磷酸化JNK(p-JNK)一抗：北京博奧森公司。山羊抗兔二抗：北京中杉金橋公司。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒：GE HEALTHCARE公司。TUNEL試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司。冰凍切片機(jī)：德國LEICA公司。倒置相差顯微鏡：日本OLYMPUS公司。凝膠成像分析系統(tǒng)：美國BIO-RAD公司。水合氯醛：國藥集團(tuán)。線栓(2636A4)：北京西濃科技有限公司。

1.3 藥物制備

黃芪20 g、墨旱蓮15 g、女貞子10 g、地龍10 g、僵蠶10 g、川芎5 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室按比例加水煎煮濃縮，冷凍備用。用時(shí)取24 g/kg，以生理鹽水配成溶液灌胃。17β-雌二醇由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院采購。灌胃容量均10 ml/kg，每天1次。

1.4 動(dòng)物分組及給藥

大鼠編號1～40，從隨機(jī)數(shù)字表第12行第1個(gè)數(shù)(48)開始，從左向右除以40，余數(shù)在1～10者分在假手術(shù)組，余數(shù)11～20者分在模型組，余數(shù)21～30者分在雌激素組，余數(shù)31～40者分在加味腦泰方組；分組出現(xiàn)分布不均，以樣本數(shù)多的假手術(shù)組、模型組樣本數(shù)除以隨機(jī)數(shù)字表中下一個(gè)隨機(jī)數(shù)字，再根據(jù)余數(shù)調(diào)整到雌激素組、加味腦泰方組，最終每組各10只大鼠。

動(dòng)物適應(yīng)喂養(yǎng)3 d后，模型組、雌激素組、加味腦泰方組行卵巢摘除術(shù)；術(shù)后11 d，雌激素組、加味腦泰方組每天分別予雌激素0.18 mg/kg、加味腦泰方24 g/kg灌胃，連續(xù)3 d，假手術(shù)組、模型組予等量生理鹽水灌胃；術(shù)后14 d，模型組、雌激素組、加味腦泰方組制備腦缺血模型。

1.5 造模方法

參照文獻(xiàn)[9]行卵巢摘除術(shù)。模型組、雌激素組、加味腦泰方組術(shù)前禁食12 h。10%水合氯醛0.35 g/kg腹腔注射麻醉。無菌條件下背部兩側(cè)切口約3 cm，扎緊輸卵管后切除卵巢?？p合切口。術(shù)后第5天開始取大鼠陰道分泌物涂片，每天1次，共5 d，以不出現(xiàn)動(dòng)情周期反應(yīng)為造模成功。假手術(shù)組背部切口后直接縫合。術(shù)后予腹腔注射青霉素每天16萬U，共3 d。

采用線栓法[10]制備大鼠腦缺血模型。大鼠卵巢摘除成功，并連續(xù)給藥3 d后，禁食12 h，于術(shù)后14 d以10%水合氯醛0.35 g/kg腹腔注射麻醉，頸正中切口，鈍性分離，暴露右頸總動(dòng)脈，分離頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈近心端及遠(yuǎn)心端。將魚線插入頸內(nèi)動(dòng)脈，深(18.5±0.5)mm，至微感阻力，固定線栓。逐層縫合。腦缺血后24 h采用Longa評分法進(jìn)行神經(jīng)功能評分[11]，1～3分為模型成功，0分和4分者剔除。假手術(shù)組切開皮膚、分離右頸總動(dòng)脈后縫合。

1.6 TUNEL染色

神經(jīng)功能評分后，每組隨機(jī)取5只大鼠，10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉，消毒后冰盒上分離大腦，取腦組織，多聚甲醛固定，石蠟切片，海馬切片行TUNEL染色。常規(guī)脫蠟，PBS洗2次；加20 μg/ml不含DNase的蛋白酶K消化30 min，PBS洗2次；加過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化酶活性，PBS洗2次；加TUNEL反應(yīng)液100 μl，37 ℃孵育60 min，PBS洗3次；加POD 37℃孵育30 min，PBS洗3次；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片，光鏡下觀察。取5個(gè)不重復(fù)高倍視野，計(jì)數(shù)視野中陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比，取均值。

1.7 Western blotting

神經(jīng)功能評分后，另5只大鼠以10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉，消毒后冰盒中取出右側(cè)海馬組織置于液氮凍存，-80℃冰箱保存。按說明書提取蛋白，考馬斯亮藍(lán)法檢測蛋白質(zhì)含量。經(jīng)灌膠、上樣、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜后，加入5%TBST-BSA室溫封閉1 h，分別加ERK1/2、JNK、p-ERK1/2、p-JNK一抗(均1∶100)和β-actin一抗(1∶500)，4 ℃搖床過夜，用TBST室溫下脫色搖床洗2次，每次10 min，再用TBS 洗 10 min。 加 入 ERK1/2、 JNK、 p-ERK1/2、p-JNK二抗(均1∶2500)，室溫孵育1 h，TBST室溫脫色搖床洗2次，每次10 min，再用TBS洗10 min。ECL化學(xué)發(fā)光法顯影1 min后，凝膠成像系統(tǒng)掃描成像，以β-actin為內(nèi)參，用Quantity One軟件分析目標(biāo)條帶的相對光密度。計(jì)算p-ERK1/2與ERK1/2、p-JNK與JNK的比值，代表ERK1/2和JNK活化程度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。各組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率及p-ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)采用單因素方差分析及LSD檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞凋亡率

假手術(shù)組偶見凋亡細(xì)胞，模型組可見較多凋亡細(xì)胞，核被染成棕黃色，胞體縮小；雌激素組和加味腦泰方組凋亡細(xì)胞數(shù)下降。見圖1。

與假手術(shù)組比較，模型組、雌激素組、加味腦泰方組細(xì)胞凋亡率顯著升高(p＜0.001)；與模型組比較，雌激素組、加味腦泰方組細(xì)胞凋亡率顯著下降(p＜0.001)；雌激素組和加味腦泰方組海馬細(xì)胞凋亡率無顯著性差異(P=0.973)。見表1。

表1 各組細(xì)胞凋亡率比較(%)

2.2 p-ERK1/2和p-JNK

與假手術(shù)組比較，模型組、雌激素組p-ERK1/2表達(dá)顯著降低(p＜0.001)，加味腦泰方組p-ERK1/2表達(dá)無顯著性差異(P=0.065)。與模型組比較，雌激素組(p＜0.01)、加味腦泰方組(p＜0.001)p-ERK1/2表達(dá)明顯升高。與雌激素組比較，加味腦泰方組p-ERK1/2表達(dá)顯著升高(p＜0.001)。見圖2、表2。

與假手術(shù)組比較，模型組、雌激素組p-JNK表達(dá)明顯升高(p＜0.01)，加味腦泰方組p-JNK表達(dá)無顯著性差異(P=0.088)。與模型組比較，雌激素組、加味腦泰方組p-JNK表達(dá)顯著降低(p＜0.001)。與雌激素組比較，加味腦泰方組p-JNK表達(dá)無顯著性差異(P=0.193)。見圖2、表2。

圖1 各組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡(TUNEL染色，400×)

表2 各組海馬ERK1/2、JNK活化程度比較

圖2 各組海馬Western blotting檢測結(jié)果

3 討論

凋亡是腦缺血再灌注后神經(jīng)元死亡的一種重要形式，有研究表明，腦缺血后細(xì)胞存活還是凋亡，取決于ERK1/2通路和JNK通路活化的動(dòng)態(tài)平衡[12]。ERK激活保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，而JNK激活導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

ERK1/2可被各種刺激磷酸化激活，p-ERK轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，進(jìn)而介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活化(磷酸化)，本身則持續(xù)活化，最終促進(jìn)細(xì)胞增殖、凋亡等[13-14]。本研究顯示，卵巢摘除腦缺血大鼠ERK1/2活化降低，與部分文獻(xiàn)報(bào)道一致[15-17]，部分文獻(xiàn)不一致[18-20]。這可能與ERK通路激活與預(yù)適應(yīng)、上調(diào)抗氧化因子轉(zhuǎn)錄等保護(hù)作用有關(guān)[18]。ERK1/2既可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，也可促進(jìn)其生長，不同作用取決于激活通路不同[21]。

JNK也可被應(yīng)激刺激激活，進(jìn)一步使核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子c-Jun氨基末端63及73位絲氨酸殘基磷酸化，進(jìn)而激活c-Jun，增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性。本研究顯示，卵巢摘除腦缺血大鼠JNK活化升高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[22]。

加味腦泰方君藥黃芪含有黃芪甲苷、黃芪多糖等多種成分，其中黃芪甲苷能抑制腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞凋亡[23]，黃芪多糖能緩解腦缺血造成的神經(jīng)元損傷[24]。川芎嗪是川芎的主要成分之一，具有抗缺血再灌注損傷作用，可能是通過下調(diào)JNK信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，減輕大鼠海馬神經(jīng)元的損傷[25]。本研究顯示，卵巢摘除腦缺血大鼠予加味腦泰方灌胃后，神經(jīng)細(xì)胞凋亡率下降，大鼠海馬ERK1/2活化升高、JNK活化降低，提示加味腦泰方通過促進(jìn)ERK通路、抑制JNK通路，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

加味腦泰方對ERK與JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作用強(qiáng)度還需進(jìn)一步應(yīng)用相應(yīng)的激活劑或抑制劑進(jìn)行觀察。加味腦泰方調(diào)節(jié)ERK、JNK通路的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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