高原，張偉波，陳健，壽崟，徐平，虎力

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，上海市201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)復(fù)雜系統(tǒng)研究中心，上海市201203

原發(fā)性肌肉衰減綜合征是一組與增齡相關(guān)的骨骼肌質(zhì)量和功能逐漸下降的綜合征[1]。2010年歐洲老年肌肉衰減綜合征工作組推薦將肌肉質(zhì)量、力量、執(zhí)行力同時(shí)降低，作為老年肌肉衰減綜合征臨床診斷的標(biāo)準(zhǔn)[2]。之后中國臺(tái)灣[3]及亞洲肌肉衰減綜合征工作組[1,4]針對(duì)歐洲標(biāo)準(zhǔn)提出修改建議。引起該綜合征的因素大概可歸結(jié)為肌肉廢用、內(nèi)分泌功能改變、慢性炎癥、胰島素抵抗(insulin resistance,IR)及營養(yǎng)缺乏[5]。骨骼肌作為人體重要的內(nèi)分泌器官，參與葡萄糖、脂質(zhì)等代謝過程[6]。在糖尿病人群中，老年女性患者具有更高的骨骼肌丟失風(fēng)險(xiǎn)[7]；鄰近70歲的女性(31%)比男性(18.2%)發(fā)生肌肉衰減的情況更多[8]。應(yīng)采用不同標(biāo)準(zhǔn)衡量男女肌肉功能受限的情況[1,9]。

高通量芯片技術(shù)一定程度顯示與疾病相關(guān)的基因變異、表達(dá)情況，生物信息學(xué)將這些差異表達(dá)的基因通過網(wǎng)絡(luò)分析及其他生物信息分析，如基因本體(gene ontology,GO)分析、通路分析，使蛋白、基因相互作用可視化、系統(tǒng)化，可用于了解疾病發(fā)生、發(fā)展中復(fù)雜的分子機(jī)制。

本研究采用公共數(shù)據(jù)平臺(tái)的基因芯片數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)分析，進(jìn)一步探討性別與老年肌肉衰減綜合征之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)

從美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information,NCBI)基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus database,GEO)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載人基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)集GSE8479?；蛐酒畔⑵脚_(tái)為GPL2700，即Sentrix HumanRef-8 Expression BeadChip類型。滿足數(shù)據(jù)集樣本共51個(gè)，包括25個(gè)老年人與26個(gè)青年人，骨骼肌組織來源于各自樣本股外側(cè)肌，包括老年男性(old male,OM)13例，青年男性(young male,YM)12例，老年女性(old female,OF)12例，青年女性(young female,YF)14例。

1.2 差異基因篩選和樣本聚類

將GSE8479芯片數(shù)據(jù)導(dǎo)入BRB-Array Tools 4.4中進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制。采用中位值將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。質(zhì)量控制要求：①截?cái)嘈盘?hào)強(qiáng)度大于10,000的值；②基因中位數(shù)至少發(fā)生1.5倍改變，且不少于20%樣本數(shù)；③對(duì)數(shù)化基因表達(dá)量變異p＜0.01；④數(shù)據(jù)缺失值≤50%。

基因過濾后，將樣本按年齡表型(OM vs.YM、OF vs.YF)篩選差異性表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs)。進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，DEGs需滿足：①p＜0.01；②倍數(shù)變化＞1為上調(diào)基因，＜1為下調(diào)基因。Venny 2.1在線軟件分析各組共同的差異基因。根據(jù)基因表達(dá)情況，判別樣本間的距離，采用中心相關(guān)和平均距離法進(jìn)行層級(jí)聚類。

1.3 差異基因功能分析和基因集富集分析

采用Cytoscape(http://www.cytoscape.org,Version 3.5.1)插件ClueGo+Cluepedia整合京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路術(shù)語，構(gòu)建DEGs的功能分組通路網(wǎng)絡(luò)。以KEGG通路術(shù)語作為聚類準(zhǔn)則，采用雙向(富含/缺失)超幾何檢驗(yàn)，通過Bonferroni校正后，以顯著性水平α=0.05查找有影響的基因通路。用Cytoscape插件CytoKegg顯示DEGs最顯著的通路。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將DEGs導(dǎo)入相互作用基因庫檢索工具(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes,STRING。http://string-db.org)數(shù)據(jù)庫，搜尋已知蛋白質(zhì)與預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)之間的相互作用，對(duì)蛋白質(zhì)之間相互作用可能性進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分＞0.4代表兩種蛋白間有中度相互作用。進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)可視化分析。采用Cytoscape進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析；采用其插件MCODE進(jìn)行子網(wǎng)絡(luò)聚類分析，得出PPI網(wǎng)絡(luò)中的相關(guān)模塊，以MCODE評(píng)分＞3、節(jié)點(diǎn)數(shù)＞4為標(biāo)準(zhǔn)，得到模塊的核心基因。

2 結(jié)果

2.1 差異基因篩選和樣本聚類

相比YM，OM篩選出DEGs 219個(gè)，其中高表達(dá)152個(gè)，低表達(dá)67個(gè)；相比YF，OF篩選出DEGs 142個(gè)，其中高表達(dá)90個(gè)，低表達(dá)52個(gè)；OM和OF共同高表達(dá)DEGs 47個(gè)，共同低表達(dá)21個(gè)(圖1)。不同性別DEGs層級(jí)聚類結(jié)果見圖1。

2.2 GO分析

OM中，DEGs共涉及9類生物過程，10類分子功能和1類細(xì)胞組分。見圖2、表1。OF中，DEGs共涉及21類生物過程，5類分子功能，1類細(xì)胞組分。見圖2、表2(生物過程只列出前10項(xiàng))。不同性別間，DEGs共涉及1類相同的生物過程，脂肪細(xì)胞的分化調(diào)節(jié)；10類相同的分子功能，蛋白激酶抑制劑活性、蛋白激酶調(diào)節(jié)劑活性、激酶抑制劑活性和激酶調(diào)節(jié)劑活性。沒有相同的細(xì)胞組分。

2.3 KEGG信號(hào)通路分析

OM中，DEGs共涉及1條KEGG通路：癌癥轉(zhuǎn)錄失調(diào)。OF中，DEGs共涉及6條KEGG通路：糖酵解/糖異生、FoxO信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路、通過細(xì)胞色素P450介導(dǎo)的外源化合物代謝、胰高血糖素信號(hào)通路、長(zhǎng)壽調(diào)控通路。見表3。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)模塊分析

OM網(wǎng)絡(luò)包括267個(gè)節(jié)點(diǎn)，1246條邊，滿足條件的模塊4個(gè)(圖3)。其中評(píng)分前三的模塊1中心基因?yàn)镈MD、TPM3、VIM與MYH8，模塊2為ZNF415，模塊3為CDKN1A(圖4)。OF網(wǎng)絡(luò)包括190個(gè)節(jié)點(diǎn)，705條邊，滿足條件的模塊7個(gè)(圖3)。其中評(píng)分前四的模塊1中心基因?yàn)镸T1H、MT1X；模塊2為DYNLL1、NEDD1，模塊3為UCP3，模塊4為BGN、LUM(圖5)。

圖1 各組DEGs數(shù)及聚類結(jié)果

圖2 GO及KEGG通路分析結(jié)果

圖3 DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)

表1 男性DEGs GO分析結(jié)果

圖4 男性PPI網(wǎng)絡(luò)中MCODE評(píng)分前三的模塊

表2 女性DEGs GO分析結(jié)果

圖5 女性PPI網(wǎng)絡(luò)中MCODE評(píng)分前四的模塊

表3 DEGs KEGG通路分析

3 討論

本研究通過比較老年肌肉衰減綜合征患者同正常青年的基因表達(dá)，篩選出不同性別的DEGs，發(fā)現(xiàn)雖然男性患者DEGs數(shù)多于女性，但GO及KEGG通路分析卻顯示，女性涉及GO類目多于男性。提示性別因素對(duì)年齡相關(guān)肌肉減少的產(chǎn)生機(jī)制存在一定影響：男性進(jìn)入老年期發(fā)生肌肉衰減時(shí)，表達(dá)變化的基因更為集中；而女性涉及的生物機(jī)制可能更復(fù)雜。

骨骼肌作為人體最大的外周胰島素靶器官[10]，約消耗80%血糖，并參與一些化合物的代謝；隨著衰老出現(xiàn)的骨骼肌衰減或萎縮可導(dǎo)致IR[11-12]。本研究顯示，男女老人部分DEGs集中于脂肪細(xì)胞分化的生物過程中，并全部高表達(dá)。研究表明，肌萎縮[13]與IR[10]可單獨(dú)或共同造成脂肪異位沉積，而成肌細(xì)胞在一定條件下還可向脂肪細(xì)胞分化[14]，提示肥胖與骨骼肌衰減有密切聯(lián)系。

DEGs富集模塊還有蛋白激酶抑制劑、調(diào)節(jié)劑活性，并同樣呈高表達(dá)。蛋白激酶參與多種細(xì)胞功能，可促進(jìn)細(xì)胞增殖及對(duì)胰島素應(yīng)答，并抑制細(xì)胞凋亡；抑制劑高表達(dá)會(huì)抑制蛋白激酶，進(jìn)而影響正常細(xì)胞生長(zhǎng)。如在衰老的肌肉組織中，細(xì)胞周期素依賴的蛋白激酶抑制劑1A(cyclin-dependent kinase inhibitor 1A,CDKN1A)活性增強(qiáng)，使靜止期肌衛(wèi)星細(xì)胞G0或G2期阻滯，導(dǎo)致靜止期細(xì)胞向活化細(xì)胞轉(zhuǎn)換，再生及自我更新能力下降[15]。針對(duì)蛋白激酶抑制劑表達(dá)和功能的調(diào)節(jié)或許是治療年齡相關(guān)肌肉丟失的潛在靶點(diǎn)[16]。

PPI網(wǎng)絡(luò)和模塊分析可判斷一個(gè)蛋白在該網(wǎng)絡(luò)中的地位[17]。本研究顯示，老年男性抗肌萎縮蛋白(dystrophin,DMD)、波形蛋白(vimentin,VIM)、原肌球蛋白α-3鏈(tropomyosin α-3,TPM3)是重要的節(jié)點(diǎn)。DMD基因是人體最大的基因之一。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)[18]，老年大鼠肌肉量丟失前期，該基因表達(dá)就已經(jīng)上調(diào)，而編碼的蛋白表達(dá)量下調(diào)。本研究結(jié)果與之一致。TPM3是一種結(jié)合于肌動(dòng)蛋白的蛋白質(zhì)，VIM則是一種中間纖維蛋白，通常被認(rèn)為是肌細(xì)胞再生指標(biāo)[19]，兩者均參與細(xì)胞骨架的構(gòu)成[20]。值得注意的是，VIM的高表達(dá)還與前列腺癌有密切聯(lián)系[21-22]，可能預(yù)示男性肌肉衰減綜合征與前列腺癌發(fā)病之間有某種聯(lián)系。

在老年女性中，金屬硫蛋白(metallothionein,MT)、動(dòng)力蛋白輕鏈(dynein light chain,DYNLL)是重要的節(jié)點(diǎn)。MT是一種富含半胱氨酸的低分子量蛋白質(zhì)，具有能與金屬離子結(jié)合的位點(diǎn)，參與調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)金屬離子代謝，尤其是鋅穩(wěn)態(tài)的過程[23]，對(duì)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)。MT1H是其4種亞型的一種，可作為診斷與治療女性乳腺癌轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)[24]。提示女性肌肉衰減綜合征與乳腺癌有關(guān)。DYNLL1屬動(dòng)力蛋白家族，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[25]；它在肌肉細(xì)胞池的富集可影響肌肉細(xì)胞長(zhǎng)度及細(xì)胞核位置[26]，而其變異與神經(jīng)系統(tǒng)疾病如脊髓側(cè)索硬化癥[27]、阿爾茨海默病[28]等有密切聯(lián)系。有研究顯示[29]，動(dòng)力蛋白與促凋亡的caspase-3在衰老小鼠神經(jīng)肌肉接頭處高表達(dá)，凋亡因子向神經(jīng)元胞體逆行轉(zhuǎn)運(yùn)。提示DYNLL1可能是神經(jīng)退行性病變與老年骨骼肌衰減癥共同靶點(diǎn)之一。

綜上所述，本研究通過生物信息學(xué)方法，挖掘與老年肌肉衰減綜合征發(fā)生相關(guān)的DEGs，并探討其性別差異，結(jié)果提示，老年肌肉衰減綜合征的發(fā)病機(jī)制可能存在性別差異，一些特定生物學(xué)過程可能與老年肌肉衰減綜合征相關(guān)；某些基因，如VIM、MT1H，可能預(yù)示著肌肉衰減綜合征還伴隨發(fā)生其他不良事件。

由于高通量芯片技術(shù)結(jié)果較多，統(tǒng)計(jì)方法存在局限，本研究結(jié)果需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)支持。

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