鄭偉，張建新，譚克，陳思澈，范逸怡，黨勝春

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院 普通外科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001）

胰腺癌是一種臨床上常見的惡性腫瘤，其發(fā)病特點(diǎn)為起病隱匿、臨床癥狀不典型、腫瘤進(jìn)展迅速，早期即可出現(xiàn)周圍組織器官的轉(zhuǎn)移。使得對(duì)于胰腺癌患者的早期診斷顯得尤為困難，多數(shù)患者確診時(shí)已屬于腫瘤晚期，手術(shù)切除率僅為10%～15%[1]，胰腺癌患者5年的生存率僅為1%～5%[2-3]。近年來吉西他濱作為輔助治療胰腺癌的一線化療藥物，但總體療效并不理想。根據(jù)Dragovich等[4]報(bào)道，單獨(dú)靜脈使用吉西他濱的臨床獲益率并不顯著，僅為23.8%。中位生存期5.7個(gè)月，6個(gè)月累計(jì)生存率46%，9個(gè)月累計(jì)生存率24%，中位疾病進(jìn)展時(shí)間2.1個(gè)月。這一現(xiàn)象提示胰腺癌細(xì)胞可能對(duì)抗癌藥物具有抗藥性，但其中的機(jī)制并不清楚。G蛋白信號(hào)調(diào)控因子2（G-protein signaling modulator 2，GPSM2）是一類信號(hào)調(diào)控因子，其主要作用是介導(dǎo)G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控，相關(guān)研究[5]發(fā)現(xiàn)，GPSM2在胰腺癌組織中呈現(xiàn)出高表達(dá)，表明高表達(dá)的GPSM2對(duì)胰腺癌的發(fā)生具有促進(jìn)作用，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)其與胰腺癌的侵襲及遷移能力有關(guān)。本研究通過構(gòu)建GPSM2敲低表達(dá)和自然高表達(dá)的胰腺癌裸鼠模型，以吉西他濱作為干擾因素。在一定時(shí)間內(nèi)觀察裸鼠模型的瘤體生長情況來分析GPSM2的低表達(dá)對(duì)胰腺癌化療敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

MIA-PaCa-2細(xì)胞株，High DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Hyclone公司），F(xiàn)BS胎牛血清（GIBCO公司），雙抗（北京夏斯生物科技有限公司），胰蛋白酶（Worthington公司），轉(zhuǎn)染試劑：Lipofectamine 2000（Invitrogen公司），realtime PCR試劑盒（南京百斯凱科技有限公司1），TRIzol（南京百斯凱科技有限公司），RNA溶解液（南京百斯凱科技有限公司），DEPC（北京博奧拓達(dá)科技有限公司），DNA凝膠回收試劑盒（天根生化科技有限公司），小量抽提試劑盒（杭州愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 構(gòu)建GPSM2低表達(dá)的慢病毒表達(dá)載體應(yīng)用Oligo軟件設(shè)計(jì)引物，正義鏈：5'-GAT CC-（GN18）-（TTC AAG AGA）-（N18C）-TTT TTT G-3'；反義鏈：3'-G（CN18）-（AAG TTC TCT）-（N18G）-AAA AAA CTT AA-5'，合成引物（上海申工合成）。將DNA Oligo分別用TE（pH8.0）溶解，濃度為100 μmol/L。取相應(yīng)的正義鏈和反義鏈Oligo溶液，按配比配置退火反應(yīng)體系。在PCR儀上進(jìn)行退火處理，退火處理后得到濃度為10 μmol/L的shRNA模板。將所得模板溶液稀釋50倍，終濃度為200 nmol/L，用于連接反應(yīng)。取 10 μG LV3載體，進(jìn)行酶切處理。37 oC 酶切 1 h，瓊脂糖電泳，使用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver 2.0回收，電泳檢測估算濃度，稀釋濃度至50 ng/μL。進(jìn)行載體的連接反應(yīng)后得到GPSM2下調(diào)表達(dá)的慢病毒表達(dá)載體。

1.2.2 GPSM2下調(diào)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建 MIAPaCa-2胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染前24 h接種于10 cm培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染前2 h再換用8 mL High DMEM新鮮培養(yǎng)基（不含抗生素，含10%FBS），轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合度為60%～70%。用GPSM2下調(diào)表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染MIA-PaCa-2細(xì)胞株，37 ℃、5%CO2孵育轉(zhuǎn)染細(xì)胞4 h后，換完全培養(yǎng)基。每2天換用含3 μg/mL Puromycin新鮮完全培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染MIA-PaCa-2細(xì)胞株45 d。

1.2.3 GPSM2下調(diào)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的鑒定 按TRIzol法分別提取MIA-PaCa-2細(xì)胞（空白對(duì)照組）、重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染的MIA-PaCa-2細(xì)胞（shRNA GPSM2轉(zhuǎn)染組）、空載慢病毒載體轉(zhuǎn)染的MIAPaCa-2細(xì)胞（陰性對(duì)照組）的總RNA，42 ℃逆轉(zhuǎn)錄50 min，72 ℃預(yù)變性10 min，獲單鏈cDNA模板。實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)體系共25 μL，反應(yīng)程序：95 ℃3 min，95 ℃ 30 s、55 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s 40個(gè)循環(huán)；然后72 ℃延伸 10 min。采用RQ=2-△△CT進(jìn)行計(jì)算GPSM2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 裸鼠成瘤模型的構(gòu)建 裸鼠16只，雄性，4～6周齡，18～22 g。隨機(jī)分兩組，每組8只，于無特定病原體（SPF）條件下飼養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物獲得了江蘇大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。胰蛋白酶消化處于對(duì)數(shù)生長期，生長狀態(tài)良好的GPSM2低表達(dá)與自然表達(dá)的MIA-PaCa-2細(xì)胞，分別制成5×106/mL細(xì)胞懸液，一組用1 mL注射器取0.20 mL GPSM2下調(diào)表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)胰腺癌細(xì)胞株懸液接種于裸鼠右側(cè)腋窩皮下[6]（每只裸鼠接種1×106個(gè)細(xì)胞）；另一種用1 mL注射器取0.20 mL GPSM2自然表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)胰腺癌細(xì)胞株懸液接種于裸鼠右側(cè)腋窩皮下（每只裸鼠接種1×106個(gè)細(xì)胞）。接種后于SPF條件飼養(yǎng)2周，按瘤體生長曲線穩(wěn)定，自發(fā)消退率低，裸鼠反應(yīng)性低、壽命一定，瘤體病理學(xué)檢測與對(duì)應(yīng)接種細(xì)胞一致等條件[7]作為裸鼠成瘤模型構(gòu)建成功標(biāo)準(zhǔn)，并進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 腫瘤化療敏感性實(shí)驗(yàn) 構(gòu)建好的裸鼠成瘤模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組：將上述兩組裸鼠再各自分為兩組。采用腹腔注射的給藥方式，一組注射吉西他濱，注射劑量100 mg/kg，另一組注射等體積生理鹽水，每周注射3次（每周一、三、五各注射1次），連續(xù)注射4周。每周4次用游標(biāo)卡尺測量并記錄各組裸鼠瘤體長徑及短徑（每周首次注射前及每次注射后24 h），末次注射后第3天取瘤體測量瘤體長短經(jīng)，共測量16次。計(jì)算瘤體體積（V）變化，V=a2×b/2（a為瘤體長徑、b為瘤體短徑），以裸鼠瘤體體積的平均值繪制腫瘤生長曲線。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用RQ=2-△△CT進(jìn)行計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。計(jì)量資料實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。3組細(xì)胞mRNA表達(dá)量差異及腫瘤體積差異用單因素方差分析，GPSM2表達(dá)與吉西他濱間的交互作用采用析因設(shè)計(jì)方差分析。SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，作圖用的是Graphpad prism 5軟件，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 GPSM2表達(dá)下調(diào)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的鑒定

為了驗(yàn)證GPSM2下調(diào)表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株是否構(gòu)建成功，對(duì)各組細(xì)胞株的GPSM2 mRNA進(jìn)行了熒光定量RCP檢測，結(jié)果顯示陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組的GPSM2 mRNA表達(dá)量明顯高于shRNA GPSM2轉(zhuǎn)染組GPSM2 mRNA表達(dá)量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P=0.000），分別為后者的39.5倍和45.5倍；而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.058）（圖1）。

圖1 各組細(xì)胞GPSM2 mRNA表達(dá)量Figure 1 Expression levels of GPSM2 mRNA in each group of cells

2.2 各組裸鼠瘤體生長形態(tài)

各組裸鼠瘤體形態(tài)分析顯示，GPSM2自然表達(dá)+生理鹽水組裸鼠的瘤體體積最大，GPSM2自然表達(dá)+吉西他濱組瘤體體積稍大于GPSM2低表達(dá)+生理鹽水組，GPSM2低表達(dá)+吉西他濱組瘤體最小（圖2）。

2.3 各組裸鼠瘤體體積變化情況

選取每周首次注射前及每次注射后24 h（共4周）及末次注射后3 d取瘤體16個(gè)時(shí)間點(diǎn)，測量并計(jì)算瘤體體積，繪制各組裸鼠瘤體的生長曲線。裸鼠瘤體體積生長速度及瘤體體積大小均為：GPSM2自然表達(dá)+生理鹽水組＞GPSM2自然表達(dá)+吉西他濱組＞GPSM2低表達(dá)+生理鹽水組＞GPSM2低表達(dá)+吉西他濱組（圖3）。析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果示（表1）：⑴ 注射吉西他濱對(duì)于抑制裸鼠瘤體生長的主效應(yīng)具有明顯意義（P=0.000）；⑵ 抑制GPSM2基因表達(dá)對(duì)于抑制裸鼠瘤體生長的主效應(yīng)具有明顯意義（P=0.000）；⑶ 注射吉西他濱與抑制GPSM2基因表達(dá)對(duì)于抑制裸鼠瘤體生長的交互效應(yīng)尚未達(dá)到明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.073）。同時(shí)單因素方差分析顯示，吉西他濱聯(lián)合下調(diào)GPSM2基因表達(dá)對(duì)于腫瘤生長的抑制作用相對(duì)于單獨(dú)吉西他濱或單獨(dú)下調(diào)GPSM2基因表達(dá)的單獨(dú)效應(yīng)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000、0.003）。

圖2 各組移植瘤大體情況 A：GPSM2自然表達(dá)+生理鹽水組；B：GPSM2自然表達(dá)+吉西他濱組；C：GPSM2低表達(dá)+生理鹽水組；D：GPSM2低表達(dá)+吉西他濱組Figure 2 The tumor xenografts in each group A: Natural GPSM2 expression plus saline group; B: Natural GPSM2 expression plus gemcitabine group; C: Low GPSM2 expression plus saline group; D: Low GPSM2 expression plus gemcitabine group

圖3 移植瘤生長曲線Figure 3 Growth curves of the tumor xenografts

表1 各組裸鼠瘤體體積及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果Table 1 The tumor volume and statistical analysis of the nude mice were analyzed

3 討 論

G蛋白偶聯(lián)受體（G protein coupled receptors，GPCRs）是一類位于細(xì)胞膜表面，擁有7個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)超家族[8]，它是人體細(xì)胞內(nèi)最為重要的信號(hào)通路，目前發(fā)現(xiàn)其參與了心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)等多個(gè)系統(tǒng)疾病、腫瘤的發(fā)生及腫瘤微血管生成，通過抑制GPCR可促進(jìn)腫瘤血管正?；痆9-10]。由于是一種信號(hào)通路，決定了其作為藥物靶點(diǎn)的特性，據(jù)報(bào)道[11]，在已發(fā)現(xiàn)的5 0 0個(gè)藥物靶點(diǎn)中，絕大多數(shù)屬于GPCR。而臨床上大約有40%的藥物是以GPCR作為靶點(diǎn)[12-13]。

GPSM是一類負(fù)性調(diào)控GPCR的蛋白質(zhì)家族。早在1996年，Dohlman等[14]在酵母中發(fā)現(xiàn)GPSM蛋白。目前證實(shí)其廣泛表達(dá)于人體各種組織細(xì)胞當(dāng)中，且都擁有一個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域[15-16]。這個(gè)結(jié)構(gòu)域是GPSM發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的基礎(chǔ)，去掉該結(jié)構(gòu)域?qū)?dǎo)致GPSM蛋白失去活性。研究[17]顯示GPSM蛋白是一種G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)性調(diào)控的鳥苷酸酶激活蛋白（GTPase activating proteins，GAPs）。通過與G蛋白偶聯(lián)受體的Gα亞基結(jié)合，顯著增加GTP酶的活性（加快達(dá)1 000倍），縮短激活的Gα-GTP的半衰期，從而抑制G蛋白信號(hào)通路，最終產(chǎn)生各種生物效應(yīng)[18]。目前發(fā)現(xiàn)GPSM在人體內(nèi)的表達(dá)參與了多種信號(hào)通路的調(diào)控，并發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)性聽力損傷、高血壓、心臟病等一系列疾病相關(guān)[19-22]。研究[23]顯示GPSM與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及耐藥形成有關(guān)。GPSM的表達(dá)產(chǎn)物參與了細(xì)胞的有絲分裂過程，通過調(diào)控細(xì)胞紡錘體的定位，影響細(xì)胞有絲分裂的G2/S期，進(jìn)而對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著重要影響。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)，GPSM的表達(dá)與腫瘤血管異常有關(guān)[24-26]。Hamzah等[27]通過研究發(fā)現(xiàn)，GPSM5的缺失可促使腫瘤血管正?；?，有學(xué)者[28]提出GPSM通過影響腫瘤血管的正?；档土四[瘤放化療及免疫治療的療效，但是其中的機(jī)制并不清楚。我們猜想可能與GPCR信號(hào)通路抑制有關(guān)。

GPSM分為6個(gè)亞組，即GPSM2屬于B/R4亞組中的一員[29]，在基因人染色體中的定位區(qū)域?yàn)?q31-1q32，其結(jié)構(gòu)包括5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子。其編碼的蛋白質(zhì)包含一個(gè)由120個(gè)氨基酸組成的高度保守的結(jié)構(gòu)域[30]。主要表達(dá)與人體細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核[31]。目前發(fā)現(xiàn)GPSM2在多種惡性腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)。研究[32-33]發(fā)現(xiàn)GPSM2與前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病有直接關(guān)系。但是有關(guān)GPSM2在胰腺癌當(dāng)中的研究較少。

通過前期研究[34]，本課題組在胰腺癌組織中檢測到GPSM2呈現(xiàn)出明顯的高表達(dá)，且GPSM2的表達(dá)水平還與胰腺癌的TNM分期及腫瘤分化程度相關(guān)，進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的GPSM2促進(jìn)了胰腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。但是未對(duì)GPSM2與胰腺癌化療敏感性做相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)通過在前期研究所獲結(jié)果的基礎(chǔ)上。通過構(gòu)建動(dòng)物模型，以吉西他濱作為處理因素來探討GPSM2的表達(dá)對(duì)胰腺癌化療敏感性的影響。

為了探索GPSM2對(duì)胰腺癌化療敏感性的影響，本研究通過構(gòu)建GPSM2敲低表達(dá)和自然高表達(dá)的胰腺癌裸鼠模型來探索這一問題，首先筆者根據(jù)前期研究的成果，發(fā)現(xiàn)在胰腺癌的眾多細(xì)胞株中，MIA-PaCa-2細(xì)胞株中GPSM2的表達(dá)量明顯較其他細(xì)胞株高，所以構(gòu)建GPSM2敲低表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染MIA-PaCa-2細(xì)胞株得到GPSM2下調(diào)表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)胰腺癌細(xì)胞株（GPSM2 homo 1211轉(zhuǎn)染的MIA-PaCa-2細(xì)胞株），通過檢測比較兩組細(xì)胞株中mRNA的表達(dá)水平來鑒定GPSM2下調(diào)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株是否構(gòu)建成功，本研究通過RT-PCR技術(shù)測得下調(diào)表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)胰腺癌細(xì)胞株（GPSM2 homo 1211轉(zhuǎn)染的MIA-PaCa-2細(xì)胞株）的表達(dá)水平明顯較MIA-PaCa-2細(xì)胞株低，表明GPSM2下調(diào)表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建成功。然后分別選用下調(diào)表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)胰腺癌細(xì)胞株（GPSM2 homo 1211轉(zhuǎn)染的MIA-PaCa-2細(xì)胞株）和MIA-PaCa-2細(xì)胞株，構(gòu)建裸鼠成瘤模型。結(jié)果顯示：成功構(gòu)建了GPSM2下調(diào)表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)胰腺癌細(xì)胞株。多因素析因設(shè)計(jì)方差分析腫瘤化療敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：⑴ 吉西他濱對(duì)于抑制裸鼠瘤體生長的主效應(yīng)具有明顯意義（P=0.000），表明吉西他濱對(duì)于裸鼠瘤體的生長具有明顯的抑制作用。⑵ 下調(diào)GPSM2基因表達(dá)對(duì)于抑制裸鼠瘤體生長的主效應(yīng)具有明顯意義（P=0.000），表明抑制GPSM2基因的表達(dá)對(duì)裸鼠瘤體的生長具有抑制作用。⑶ 注射吉西他濱與抑制GPSM2基因表達(dá)對(duì)于抑制裸鼠瘤體生長的交互效應(yīng)尚未達(dá)到明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.073），表明本研究過程中，抑制GPSM2基因的表達(dá)對(duì)于增強(qiáng)吉西他濱化療敏感性尚不明顯。但單因素方差分析將實(shí)驗(yàn)注射組裸鼠瘤體體積大小分別與對(duì)照注射組、實(shí)驗(yàn)未注射組比較均有明顯差異（P=0.000、0.003），說明通過抑制GPSM2基因表達(dá)的同時(shí)予以化療對(duì)于裸鼠瘤體生長的抑制作用較單獨(dú)抑制GPSM2基因表達(dá)和單獨(dú)化療更為有效。通過分析和討論有關(guān)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理、實(shí)施方案以及相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果，并查閱相關(guān)文獻(xiàn)。筆者認(rèn)為在本研究的過程中，裸鼠模型的樣本數(shù)量、裸鼠情況及吉西他濱注射劑量可能對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的偏差產(chǎn)生了一定影響，使本研究未達(dá)到預(yù)期成果。根據(jù)本研究結(jié)果，得出以下結(jié)論：⑴ 抑制GPSM2基因的表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞生長具有抑制作用。⑵ 抑制GPSM2基因表達(dá)對(duì)于增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞化療敏感性的作用尚未具有明顯意義，但通過抑制GPSM2基因表達(dá)的同時(shí)予以化療對(duì)于抑制胰腺癌細(xì)胞生長的效果較單獨(dú)抑制GPSM2基因表達(dá)和單獨(dú)化療更為有效，對(duì)于增加胰腺癌的化療療效同樣具有明顯的作用。通過檢測胰腺癌組織中GPSM2的表達(dá)可能成為增加胰腺癌患者化療療效的重要指標(biāo)，并以GPSM2作為靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)針對(duì)GPSM2的靶向治療藥物，有望改善胰腺癌患者的治療效果。

后續(xù)研究將擴(kuò)大動(dòng)物模型樣本數(shù)量、采用不同吉西他濱注射劑量以及構(gòu)建耐藥動(dòng)物模型，并通過細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)和相關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證GPSM2的表達(dá)對(duì)胰腺癌化療敏感性的影響。

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