朱怡 張云

（蘇州大學 江蘇 蘇州 215000）

線蟲為線蟲動物門(Aschelminthes)線蟲綱(Nematoda)所有蠕蟲的通稱，系動物界中數(shù)量最豐者之一，寄生于動、植物，或自由生活于土壤、淡水和海水環(huán)境中。這里所說的線蟲特指秀麗隱桿線蟲（C.elegans），是一種常見的、自由生活的小型土壤線蟲，以細菌為食。因其遺傳背景清楚、個體結(jié)構(gòu)簡單、生活史短、基因組測序完成等，秀麗隱桿線蟲作為模式生物在遺傳與發(fā)育生物學、行為與神經(jīng)生物學、衰老與壽命、人類遺傳性疾病、病原體與生物機體的相互作用、藥物篩選、動物的應急反應、環(huán)境生物學和信號傳導等領域得到廣泛應用。

在大多數(shù)動物中，表皮是與外界環(huán)境接觸、抵御外界病原體和損傷的第一道屏障。目前的研究表明，對秀麗隱桿線蟲表皮進行物理損傷可以引起線蟲固有免疫應答以及傷口愈合反應，因此研究秀麗隱桿線蟲的物理損傷有重大意義。目前對線蟲進行物理損傷的研究通常采用激光照射或顯微針刺的方法，由于秀麗隱桿線蟲成蟲體長約1mm，肉眼難以辨別，對其進行激光照射或顯微針刺難度較大，若需要批量損傷，操作費時費力，損傷程度無法均一，樣本收集不方便，結(jié)果重復性較差，容易導致樣本死亡，且傷口數(shù)量少，無法滿足研究的需要。之前的研究證實，批量處理的線蟲可用于新藥篩選，將其分布于小分子化合物庫中，利用染料染色等方法可篩選得到目的化合物，因此我們需要一種可以簡便的對大批量線蟲進行物理損傷的方法，以用于進行促進傷口愈合的新藥篩選。

針對上述現(xiàn)有技術中的缺陷，我們要解決的技術問題是提供一種簡便易行的線蟲物理損傷新方法，利用玻璃碎片對線蟲進行物理損傷，傷口多，存活率高，重復性好，可以滿足批量損傷的需要。

為解決上述技術問題，我們所采取的技術方案是：

本實驗提供一種利用玻璃碎片對線蟲進行物理損傷的方法，具體步驟為：于NGM平板表面鋪一層玻璃碎片，將帶有線蟲的NGM瓊脂塊帶有所述線蟲一面置于所述NGM平板的玻璃碎片上，適當按壓所述NGM瓊脂塊讓瓊脂塊緊貼平板，放置25～35分鐘，然后將所述NGM瓊脂塊轉(zhuǎn)移至一新NGM平板上，得到損傷效果均一的線蟲樣本。

其中，所述玻璃碎片由毛細玻璃管研磨得到，所述毛細玻璃管壁厚0.25mm。玻璃碎片依靠重力作用在水或乙醇中進行分離，使用75%乙醇溶液，達到去除過大或過小的碎片。由imageJ進行測量并分析每個玻璃碎片的最長軸線，由此得到的玻璃碎片的最長軸線為10～100um。將玻璃碎片用75%乙醇洗滌并儲存在M9緩沖液中，保持玻璃碎片的清潔和完整。

具體操作步驟：

取一根0.25mm厚的毛細玻璃管，折斷成小段放入研缽中進行研磨，直到玻璃碎片最長軸線為100um以下。將研磨得到的玻璃碎片放入75%乙醇溶液中，依靠不同大小的碎片在溶液中靠重力的沉降時間的差異，除去過大或過小的碎片，得到的玻璃碎片用imageJ進行測量并分析，測得玻璃碎片的最長軸線為10～100um（見圖3）。得到的玻璃碎片（見圖2）用于對線蟲進行物理損傷。將得到的玻璃碎片用75%乙醇洗滌并儲存在M9緩沖液中待用。

制作一個秀麗隱桿線蟲生長的NGM平板，將上述玻璃碎片均勻平鋪于NGM平板表面上，取一塊帶有數(shù)百條秀麗隱桿線蟲的NGM瓊脂塊，倒置于放有玻璃碎片的平板上，使秀麗隱桿線蟲與玻璃碎片充分接觸，輕壓瓊脂塊并放置25～35分鐘，以使玻璃碎片的尖銳邊緣對秀麗隱桿線蟲造成物理損傷。然后將瓊脂塊轉(zhuǎn)移至新NGM平板上，完成對秀麗隱桿線蟲的物理損傷。壓力不得過大，以免造成秀麗隱桿線蟲損傷過大，同時也要保持瓊脂塊的完整，便于后期的轉(zhuǎn)移。此過程示意圖見圖1。

本實驗中對線蟲樣本進行物理損傷，造成的傷口較淺，存活率高（見圖4）。用玻璃碎片對線蟲進行物理損傷，線蟲存活率為98%，針刺損傷存活率為53%（見圖5)。同時本方法對線蟲造成的傷口較多，對線蟲進行玻璃損傷的傷口數(shù)量與針刺方法的傷口數(shù)量比為6∶1（見圖6）。使用本方法對線蟲損傷效果均一，重復性好，易得到損傷效果一致的樣本。使用本方法物理損傷的線蟲進行QPCR實驗，結(jié)果重復性好，抗菌肽上調(diào)倍數(shù)在5.8至7.2之間（見圖7）。另外，此方法便于收集樣本，所得到損傷效果一致的線蟲樣本直接收集到瓊脂塊上，減少了轉(zhuǎn)移環(huán)節(jié)，既節(jié)省程序，又減少了線蟲在轉(zhuǎn)移過程中的其它損傷和死亡。本方法中使用的材料簡單，不需使用大型儀器設備，節(jié)約時間和使用成本，簡便易行，適于批量損傷。使用本方法大批量對線蟲進行物理損傷后收集的樣本可進行促進傷口愈合的新藥篩選。

圖1

圖2

圖3

圖4

圖5

圖6

圖7