朱怡 張?jiān)?/p>

（蘇州大學(xué) 江蘇 蘇州 215000）

線蟲為線蟲動(dòng)物門(Aschelminthes)線蟲綱(Nematoda)所有蠕蟲的通稱，系動(dòng)物界中數(shù)量最豐者之一，寄生于動(dòng)、植物，或自由生活于土壤、淡水和海水環(huán)境中。這里所說的線蟲特指秀麗隱桿線蟲（C.elegans），是一種常見的、自由生活的小型土壤線蟲，以細(xì)菌為食。因其遺傳背景清楚、個(gè)體結(jié)構(gòu)簡單、生活史短、基因組測序完成等，秀麗隱桿線蟲作為模式生物在遺傳與發(fā)育生物學(xué)、行為與神經(jīng)生物學(xué)、衰老與壽命、人類遺傳性疾病、病原體與生物機(jī)體的相互作用、藥物篩選、動(dòng)物的應(yīng)急反應(yīng)、環(huán)境生物學(xué)和信號(hào)傳導(dǎo)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

在大多數(shù)動(dòng)物中，表皮是與外界環(huán)境接觸、抵御外界病原體和損傷的第一道屏障。目前的研究表明，對(duì)秀麗隱桿線蟲表皮進(jìn)行物理損傷可以引起線蟲固有免疫應(yīng)答以及傷口愈合反應(yīng)，因此研究秀麗隱桿線蟲的物理損傷有重大意義。目前對(duì)線蟲進(jìn)行物理損傷的研究通常采用激光照射或顯微針刺的方法，由于秀麗隱桿線蟲成蟲體長約1mm，肉眼難以辨別，對(duì)其進(jìn)行激光照射或顯微針刺難度較大，若需要批量損傷，操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力，損傷程度無法均一，樣本收集不方便，結(jié)果重復(fù)性較差，容易導(dǎo)致樣本死亡，且傷口數(shù)量少，無法滿足研究的需要。之前的研究證實(shí)，批量處理的線蟲可用于新藥篩選，將其分布于小分子化合物庫中，利用染料染色等方法可篩選得到目的化合物，因此我們需要一種可以簡便的對(duì)大批量線蟲進(jìn)行物理損傷的方法，以用于進(jìn)行促進(jìn)傷口愈合的新藥篩選。

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，我們要解決的技術(shù)問題是提供一種簡便易行的線蟲物理損傷新方法，利用玻璃碎片對(duì)線蟲進(jìn)行物理損傷，傷口多，存活率高，重復(fù)性好，可以滿足批量損傷的需要。

為解決上述技術(shù)問題，我們所采取的技術(shù)方案是：

本實(shí)驗(yàn)提供一種利用玻璃碎片對(duì)線蟲進(jìn)行物理損傷的方法，具體步驟為：于NGM平板表面鋪一層玻璃碎片，將帶有線蟲的NGM瓊脂塊帶有所述線蟲一面置于所述NGM平板的玻璃碎片上，適當(dāng)按壓所述NGM瓊脂塊讓瓊脂塊緊貼平板，放置25～35分鐘，然后將所述NGM瓊脂塊轉(zhuǎn)移至一新NGM平板上，得到損傷效果均一的線蟲樣本。

其中，所述玻璃碎片由毛細(xì)玻璃管研磨得到，所述毛細(xì)玻璃管壁厚0.25mm。玻璃碎片依靠重力作用在水或乙醇中進(jìn)行分離，使用75%乙醇溶液，達(dá)到去除過大或過小的碎片。由imageJ進(jìn)行測量并分析每個(gè)玻璃碎片的最長軸線，由此得到的玻璃碎片的最長軸線為10～100um。將玻璃碎片用75%乙醇洗滌并儲(chǔ)存在M9緩沖液中，保持玻璃碎片的清潔和完整。

具體操作步驟：

取一根0.25mm厚的毛細(xì)玻璃管，折斷成小段放入研缽中進(jìn)行研磨，直到玻璃碎片最長軸線為100um以下。將研磨得到的玻璃碎片放入75%乙醇溶液中，依靠不同大小的碎片在溶液中靠重力的沉降時(shí)間的差異，除去過大或過小的碎片，得到的玻璃碎片用imageJ進(jìn)行測量并分析，測得玻璃碎片的最長軸線為10～100um（見圖3）。得到的玻璃碎片（見圖2）用于對(duì)線蟲進(jìn)行物理損傷。將得到的玻璃碎片用75%乙醇洗滌并儲(chǔ)存在M9緩沖液中待用。

制作一個(gè)秀麗隱桿線蟲生長的NGM平板，將上述玻璃碎片均勻平鋪于NGM平板表面上，取一塊帶有數(shù)百條秀麗隱桿線蟲的NGM瓊脂塊，倒置于放有玻璃碎片的平板上，使秀麗隱桿線蟲與玻璃碎片充分接觸，輕壓瓊脂塊并放置25～35分鐘，以使玻璃碎片的尖銳邊緣對(duì)秀麗隱桿線蟲造成物理損傷。然后將瓊脂塊轉(zhuǎn)移至新NGM平板上，完成對(duì)秀麗隱桿線蟲的物理損傷。壓力不得過大，以免造成秀麗隱桿線蟲損傷過大，同時(shí)也要保持瓊脂塊的完整，便于后期的轉(zhuǎn)移。此過程示意圖見圖1。

本實(shí)驗(yàn)中對(duì)線蟲樣本進(jìn)行物理損傷，造成的傷口較淺，存活率高（見圖4）。用玻璃碎片對(duì)線蟲進(jìn)行物理損傷，線蟲存活率為98%，針刺損傷存活率為53%（見圖5)。同時(shí)本方法對(duì)線蟲造成的傷口較多，對(duì)線蟲進(jìn)行玻璃損傷的傷口數(shù)量與針刺方法的傷口數(shù)量比為6∶1（見圖6）。使用本方法對(duì)線蟲損傷效果均一，重復(fù)性好，易得到損傷效果一致的樣本。使用本方法物理損傷的線蟲進(jìn)行QPCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果重復(fù)性好，抗菌肽上調(diào)倍數(shù)在5.8至7.2之間（見圖7）。另外，此方法便于收集樣本，所得到損傷效果一致的線蟲樣本直接收集到瓊脂塊上，減少了轉(zhuǎn)移環(huán)節(jié)，既節(jié)省程序，又減少了線蟲在轉(zhuǎn)移過程中的其它損傷和死亡。本方法中使用的材料簡單，不需使用大型儀器設(shè)備，節(jié)約時(shí)間和使用成本，簡便易行，適于批量損傷。使用本方法大批量對(duì)線蟲進(jìn)行物理損傷后收集的樣本可進(jìn)行促進(jìn)傷口愈合的新藥篩選。

圖1

圖2

圖3

圖4

圖5

圖6

圖7