張華婷 高瑩瑩 徐朝暉

（中藥現(xiàn)代制劑技術(shù)教育部工程研究中心，上海中醫(yī)藥大學(xué) 上海 201203）

糖尿病性視網(wǎng)膜病變（Diabetic Retinopathy，DR）是糖尿病的常見并發(fā)癥之一，當(dāng)前已成為成年人致盲的主要原因,其嚴(yán)重性日益引起關(guān)注[1]。DR是一種多因素疾病，其發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜。最初，DR被認(rèn)為是內(nèi)皮功能障礙的微血管并發(fā)癥，然而目前公認(rèn)的是DR影響幾乎所有類型的視網(wǎng)膜細(xì)胞[2]。TLFA是一類從中藥材牛蒡子中分離得到的木脂素類化合物[3]，在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)TLFA具有顯著的醛糖還原酶抑制活性[4]，本研究旨在此基礎(chǔ)上，通過測定TLFA對SD大鼠RMECs遷移和VEGF蛋白表達(dá)的影響進(jìn)一步探討TLFA治療DR的理論依據(jù)。

1.資料與方法

1.1 一般資料

儀器1-15K型多功能酶標(biāo)儀（美國Sigma公司）；Stratagene MX3005p型熒光定量PCR儀（美國Agilent公司）；CX23型倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

藥物與試劑牛蒡子總木脂素（自制，制備方法見參考文獻(xiàn)[5]）；培養(yǎng)試劑：RPMI-1640，胎牛血清,PBS購自美國Lifetechnologies公司。RNA提取試劑盒購自Ambion公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和qPCR試劑盒購自Invitrogen公司。

動物SD大鼠5只，雄性，體重250～300g，清潔級，購于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司。

圖1 細(xì)胞劃痕修復(fù)試驗(yàn)結(jié)果

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞遷移劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)方法[6]，無菌取下大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)層，收集RMECs細(xì)胞，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為空白對照組(T0)和高(T20)、中(T10)、低(T5)三個劑量組(各組培養(yǎng)基中TLFA的濃度分別為20，10和5mg/L)。每組重復(fù)3個，將大鼠RMECs細(xì)胞以3×105/孔的密度接種于培養(yǎng)板，以RPMI 1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）培養(yǎng)。待細(xì)胞達(dá)到90%生長密度后，改用RPMI 1640（無血清）培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)，24小時后用200μL無菌Tip頭在細(xì)胞培養(yǎng)孔中對細(xì)胞作一個長條形約0.8mm寬度的劃痕,劃除的細(xì)胞用無血清培養(yǎng)液沖洗干凈。按實(shí)驗(yàn)分組加入相應(yīng)的試劑后，置于5%CO2、37℃的恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。0,24,48小時后于倒置顯微鏡下拍攝10×10倍的照片記錄。

1.2.2 RT-PCR檢測VEGF表達(dá) 在對數(shù)生長期取大鼠RMECs細(xì)胞，用1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）制備2×104/mL的細(xì)胞懸液，以1mL/孔的量接種于6孔培養(yǎng)板，于恒溫培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中培養(yǎng)24小時后換液，每組設(shè)6個平行孔，按前述分組分別培養(yǎng)24、48、72小時后取樣檢測VEGF表達(dá)量。參照試劑盒說明書提取RMECs總RNA,按照cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。終止反應(yīng)后，在PCR反應(yīng)板中加入qPCR Super Mix Universal 10μL，c-DNA 模板 0.5μL，ddH2O 11μL，VEGF(上游5'－TCG GGC CTC CGA AAC CAT GA－3'，下游5'－CCT GGT GAG AGA TCT GGT TC－3')和GAPDH(上游5'－GGA AAG CTG TGG CGT GAT GG－3'，下游5'－TAT CCT TGC TGG GCT GGG TG－3')引物各0.5μL，PCR的反應(yīng)體系為25μL。PCR反應(yīng)條件∶50℃，2分鐘，95℃，10分鐘，40cycles；95℃，15sec，60℃，60sec。按照儀器使用說明進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，收集數(shù)據(jù)，分析結(jié)果。

2.結(jié)果

2.1 細(xì)胞遷移劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)

如圖所示。當(dāng)TLFA的濃度為5mg/L時，對RMECs的遷移抑制作用不明顯；當(dāng)TLFA的濃度分別為10，20mg/L時，在24和48小時兩個時間點(diǎn)均觀察到它們對RMECs的遷移具有顯著的抑制作用，且20mg/L組的抑制作用強(qiáng)于10mg/L組。

2.2 對RMECs VEGF mRNA表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表，經(jīng)培養(yǎng)24,48,72小時后，（1）T0和T5組內(nèi)皮細(xì)胞VEGF mRNA的表達(dá)平緩上升，各時間點(diǎn)兩組數(shù)據(jù)之間無顯著性差異；（2）T10組內(nèi)皮細(xì)胞VEGF mRNA的表達(dá)雖漸次略有上升，但其表達(dá)量均明顯比T0組的低，且2組數(shù)據(jù)之間具有顯著性差異；（3）T20組內(nèi)皮細(xì)胞VEGF mRNA的表達(dá)未現(xiàn)增長趨勢，在72小時時還略有下降。其表達(dá)量均明顯比T0組各時間點(diǎn)的低，且2組數(shù)據(jù)之間的差異更加顯著。表明TLFA對微血管內(nèi)皮細(xì)胞的抑制作用呈濃度依賴性，該結(jié)果也與細(xì)胞劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

表 TLFA對RMECsVEGF mRNA表達(dá)的影響n=6,±s

表 TLFA對RMECsVEGF mRNA表達(dá)的影響n=6,±s

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.01

分組 VEGF mRNA表達(dá)24h 48h 72h T0 0.653±0.059 0.755±0.067 0.876±0.075 T5 0.594±0.052 0.705±0.062 0.838±0.071 T10 0.581±0.046* 0.645±0.053* 0.697±0.062**T20 0.543±0.041** 0.550±0.039*** 0.523±0.043***

3.討論

前期研究發(fā)現(xiàn)糖尿病視網(wǎng)膜病變與新生血管形成過程和生長因子過度表達(dá)密切相關(guān)，視網(wǎng)膜新生血管形成和血-視網(wǎng)膜屏障的破壞在DR的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，而VEGF已經(jīng)被認(rèn)為是引起血-視網(wǎng)膜屏障破壞的主要原因[7],其它一些血管滲透性因子通過VEGF間接起作用。因此阻斷VEGF及其受體從而達(dá)到治療目的，已成為治療DR的主要思路之一。

本研究細(xì)胞劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：各濃度TLFA對RMECs的遷移具有不同程度的抑制作用，且抑制作用的強(qiáng)弱呈劑量依賴性。為了進(jìn)一步探討TLFA對RMECs遷移抑制作用的機(jī)制，本研究對不同濃度TLFA作用下的RMECs采用熒光定量RT－PCR方法檢測了VEGF mRNA的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TLFA能夠下調(diào)VEGF mRNA的表達(dá)，且隨著TLFA濃度的增加和作用時間的延長，其抑制作用也相應(yīng)增強(qiáng)。說明TLFA對RMECs中VEGF mRNA表達(dá)的抑制作用呈濃度－時間依賴性，抑制VEGF mRNA表達(dá)可能是其抑制RMECs遷移的一個重要機(jī)制，它可能通過抑制VEGF的表達(dá)而抑制視網(wǎng)膜新生血管的形成,從而對DR產(chǎn)生治療作用。

本研究結(jié)果表明，除了醛糖還原酶抑制活性之外，TLFA還可以抑制視網(wǎng)膜RMECs中VEGF mRNA表達(dá)，從而抑制視網(wǎng)膜新生血管的形成。上述兩種作用機(jī)制為其對DR的治療前景提供了理論依據(jù)。

【參考文獻(xiàn)】

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