武中平，王 莉，高 巍，曹 磊，朱利利，汪洪濤，孫 牧，王薇薇

(江蘇省產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗研究院，江蘇南京 210007)

維生素是維持人體健康所必需的一類營養(yǎng)物質[1]。目前已知的維生素有數(shù)十種，絕大多數(shù)不能在體內(nèi)合成，或者所合成的量難以滿足機體的需要，必須通過日常飲食進行補充。維生素按溶解性可分為兩大類，即水溶性維生素和脂溶性維生素[2]。水溶性維生素主要包括維生素C和B族維生素，它們易溶于水。B族維生素也叫乙族維生素、維他命B、維生素B雜或維生素B復合群，常見的有硫胺素(B1)、核黃素(B2)、煙酸、煙酰胺(B3)、泛酸(B5)、吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺(B6)、生物素(B7)、葉酸(B9)、鈷胺素(B12)等[3]。這些維生素全是輔酶，有共同的特性：是把糖、脂肪、蛋白質等轉化成熱量時不可缺少的物質，可以幫助維持心臟、神經(jīng)系統(tǒng)功能，維持消化系統(tǒng)及皮膚的健康，但它們在結構上沒有同一性。如果缺少B族維生素，則細胞功能馬上降低，引起代謝障礙，人體易出現(xiàn)怠滯和食欲不振。在嬰幼兒配方奶粉中常添加一定量的B族維生素，以保證嬰幼兒攝取的需要[4]。但添加量必須控制在一定范圍，以免產(chǎn)生不良影響。因此檢測嬰幼兒配方奶粉中的B族維生素含量有著重要的現(xiàn)實意義。

目前，有一系列食品安全國家標準可用于對食品(包含嬰幼兒配方奶粉)中B族維生素的檢測[5-12]。在這些標準中，主要有3種檢測方法：①微生物法，如維生素B3(第一法)、維生素B5(第一法)、維生素B7、維生素B9、維生素B12等；②熒光分光光度法，如維生素B1(第二法)、維生素B2(第二法)等；③高效液相色譜法，包括熒光檢測器法和紫外檢測法，如維生素B1(第一法)、維生素B2(第一法)、維生素B3(第二法)、維生素B6(第一法)、維生素B5(第二法)等。微生物法靈敏度高，但操作繁鎖、培養(yǎng)時間長、對人員要求較高、影響結果的因素多，重復性稍差[13-14]。熒光分光光度法有一定的特異性，但參與反應的試劑一般都有毒性，對操作人員有一定的傷害，同時，在實驗室要對反應條件進行優(yōu)化，因此操作也較為繁瑣。采用高效液相色譜法測定B族維生素時，樣品前處理較為簡單，有較高的靈敏度，但測定時經(jīng)常采用離子對試劑，使得色譜柱壽命大大減低，同時B族維生素結構、化學性質差別大，很難用同一操作條件完成多種B族維生素分離、測定[15]。隨著質譜技術和柱填料技術的不斷發(fā)展，已有不少用液相色譜-串聯(lián)質譜法檢測食品中維生素含量的報道[16-24]。液相色譜-串聯(lián)質譜法可提供可靠、精確的相對分子質量及結構信息，具有快速、靈敏度高的特點，能更好地滿足嬰幼兒配方奶粉等復雜樣品中有機化合物的測定。

筆者對提取溶劑的種類及濃度、超聲時間等樣品前處理條件、液相色譜-串聯(lián)質譜操作條件、方法學指標、樣品實際測定進行了研究，建立了一種采用高壓液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定嬰幼兒配方奶粉中7種B族維生素含量的方法。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑Agilent1290-G6460C高壓液相色譜串聯(lián)三重四級桿質譜儀；KQ-500DE超聲波清洗器； SIGMA 3-18K高速冷凍離心機；HH-S8恒溫水浴鍋；BSA224S-CW電子分析天平；Milli-Q Integral型超純水系統(tǒng)；0.45 μm水相濾膜。

標準品：硫胺素(純度≥95.3%)、核黃素(純度≥99.9%)、吡哆醇(純度≥99.6%)、吡哆醛(純度≥99.5%)、吡哆胺(純度≥99.5%)、煙酸(純度≥99.8%)、煙酰胺(純度≥99.9%)。

單標儲備溶液：1.00 g/L，稱取硫胺素、核黃素、吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺、煙酸、煙酰胺標準品各10.0 mg，分別置于10 mL棕色容量瓶中，用0.1%甲酸溶液(體積分數(shù)，下同)溶解并定容，于-18 ℃下避光保存。

標準溶液：分別移取上述單標儲備溶液于10 mL棕色容量瓶中，用0.1%甲酸水溶液稀釋，配制質量濃度為0.1、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 mg/L的標準混合溶液，密封后避光于-18 ℃下保存。

甲醇為色譜純，甲酸、正己烷為分析純，水為Milli-Q Integral型超純水系統(tǒng)制備的一級水。

嬰幼兒配方奶粉購置于某超市。

1.2儀器工作條件液相色譜條件：Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)；流動相：A為0.1%甲酸溶液，B為甲醇；流量0.2 mL/min；柱溫25 ℃；進樣量5 μL。梯度洗脫程序：0～1.00 min時，A為99%；1.01～4.00 min時，A由99%降為45%；4.01～6.00 min時，A為45%；6.01～6.10 min時，A由45%升為99%；6.11～10.00 min時，A為99%。

質譜條件：ESI+離子化模式；霧化氣壓力40 psi；毛細管電壓4.0 kV；脫溶劑氣(氮氣)流量10 L/min；脫溶劑氣溫度350 ℃；碰撞氣高純氮(99.999%)；MRM監(jiān)測模式(監(jiān)測參數(shù)見表1)。

表1 MRM模式下的監(jiān)測參數(shù)

1.3試驗方法稱取5.0 g奶粉樣品于燒杯中，加入50 mL 0.1%甲酸溶液，在45 ℃恒溫水浴鍋中攪拌2 min，取出，加入5 mL正己烷，超聲提取20 min，取35 mL樣品溶液于離心管中，在15 ℃下以10 000 r/min離心10 min，用一次性塑料滴管小心取出5 mL中層澄清液，用0.45 μm水相濾膜過濾，棄去前面2 mL濾液，收集2 mL濾液于樣品瓶中，待測。在避光條件下進行試驗，待測樣品在最短的時間內(nèi)進行測試。

2 結果與分析

2.1流動相體系的選擇用液相色譜-串聯(lián)質譜法測定食品中水溶性維生素含量時，一般采用二元流動相體系：A為0.1%甲酸溶液或10 mmol/L醋酸銨溶液，B為甲醇或乙腈。筆者對4種流動相體系：0.1%甲酸-甲醇、0.1%甲酸-乙腈、10 mmol/L醋酸銨-甲醇、10 mmol/L醋酸銨-乙腈進行了試驗，重點考察7種待測B族維生素在不同流動相體系下的響應值。表2為7種待測B族維生素(濃度10 mg/L)在4種流動相體系下的響應值(用MS2 SIM模式下母離子峰高表示)。從表2可以看出，核黃素、吡哆醇、吡哆醛、煙酸、煙酰胺在0.1%甲酸-甲醇流動相體系下響應值最大，硫胺素、吡哆胺在10 mmol/L醋酸銨-甲醇流動相體系下響應值最大。為了使多數(shù)待測物有最大響應值，筆者選擇0.1%甲酸-甲醇作為測定時的流動相體系。

表2 不同流動相體系下的7種維生素的響應值

2.2提取溶液及濃度的選擇嬰幼兒配方奶粉含有大量的蛋白質、脂肪，還會添加較多種類的營養(yǎng)成分，使得測定其中維生素含量比較困難：一是要找到合適的提取溶液，能最大限度地將待測維生素提取出來；二是要采用合適的方式減少提取液中的蛋白質、脂肪含量，以減輕樣品測定時對儀器的損害。筆者對3種提取溶液：0.1 mol/L鹽酸、10 mmol/L醋酸銨、0.1%甲酸進行了試驗，重點考察5.0 g樣品按照“1.3”試驗方法處理后濾液的澄清度及7種待測B族維生素含量。試驗表明，用0.1 mol/L鹽酸、10 mmol/L醋酸銨作為提取溶液時，樣品溶液在離心后依然較為渾濁。而用0.1%甲酸作為提取溶液時，離心后能得到澄清液體。用不同提取溶液提取后，樣品中待測維生素的響應值也不一樣。表3為不同提取溶液提取后樣品中待測維生素的響應值(用MS2 SIM模式下母離子峰面積表示)。研究還考察了不同濃度(0.1%、1%、10%)甲酸溶液提取效果及待測維生素的響應值。試驗表明，隨著甲酸濃度的增加，經(jīng)離心后得到提取液的澄清度反而下降。用不同濃度甲酸溶液提取后，樣品中待測維生素的響應值也不同。表4為不同濃度甲酸溶液提取后樣品中待測維生素的響應值(用MRM模式下定量子離子峰面積表示)。綜合考慮后，選擇0.1%甲酸作為嬰幼兒配方奶粉中7種B族維生素測定時樣品提取溶液。

表3 3種提取液提取后樣品中待測維生素的響應值

表4 不同濃度甲酸溶液提取后樣品中待測維生素的響應值

2.3超聲時間的選擇將超聲波應用于化學分析時，應結合樣品類型、待測物性質對超聲提取時間進行優(yōu)化[25]，以確保多數(shù)待測物有較高的提取效率。筆者在確定好提取溶劑、濃度后，對相同樣品在不同超聲提取時間(10、15、20、25 min)待測維生素的提取效率進行了比較。相同樣品不同超聲提取時間待測維生素的響應值(用MRM模式下定量子離子峰面積表示)見表5。試驗數(shù)據(jù)表明，樣品中5種待測維生素(吡哆胺為未檢出)超聲提取20 min時響應值達到最大，而在超聲提取25 min后，響應值略有下降，可能是超聲波對待測維生素有一定的破壞作用，隨著超聲提取時間的延長，這種作用的效果會更明顯。

表5 不同提取時間樣品中待測維生素的響應值

2.4方法學指標驗證

2.4.1方法的線性范圍與檢出限。吸取一定體積的7種維生素的標準儲備溶液，用0.1%甲酸溶液稀釋定容，配制成0.1 mg/L(吡哆胺、煙酰胺)、1、5、10、20、50 mg/L混合標準溶液，在“1.2”條件下測定。以標準溶液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。7種待測維生素在線性范圍內(nèi)具有良好相關性。以3倍信噪比計算方法最低檢出限。線性范圍及最低檢出限的結果見表6。

表6 7種維生素的線性范圍和檢出限

2.4.2加標回收率及精密度。在5.0 g樣品中分別添加低、中、高3個濃度水平(每個濃度進行6次平行試驗)的混合標準溶液后，按“1.3”進行處理，在“1.2”條件下測定，得到其中待測維生素的峰面積，計算加標回收率和相對標準偏差。樣品加標回收率、相對標準偏差見表7。7種B族維生素加標回收率為75.25%～107.65%，相對標準偏差在3%以下，符合嬰幼兒配方奶粉中B族維生素含量測定的要求。

表7樣品加標回收率和相對標準偏差(n=6)

Table7Theaddingstandardmatteramountandstandarddeviationofthesample

名稱Name樣品實測含量Themeasuredcontentofthesample∥mg/L加標量Theaddingstandardmatteramount∥mg平均加標回收率Averagestandardrecoveryrate∥%RSD%核黃素2.260.10103.302.13Riboflavin0.2098.951.051.0088.931.14硫胺素0.060.0175.252.98Thiamine0.0278.452.450.1080.991.56吡哆醇0.460.01107.651.71Pyridoxine0.02104.180.260.1088.891.87吡哆胺未檢出0.1083.252.36Pyridoxamine0.2082.941.751.0082.511.63吡哆醛0.130.01105.500.86Pyridoxal0.02100.020.550.1081.360.98煙酸0.040.0189.201.49Niacin0.0285.831.620.1081.421.51煙酰胺3.290.1080.402.93Nicotinamide0.2089.471.121.0086.820.87

2.5實際樣品測定稱取6份相同質量的樣品，按“1.3”進行處理，在“1.2”條件下測定，得到其中待測維生素的峰面積，計算峰面積平均值和相對標準偏差，結果見表8。數(shù)據(jù)表明，奶粉中B族維生素含量實際測定值的相對標準偏差均在5%以下，說明該方法能很好測定嬰幼兒奶粉中B族維生素含量。

表8 樣品中維生素含量的平行測定(n=6)

3 結論

該研究建立了一種高壓液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定嬰幼兒配方奶粉中7種B族維生素(核黃素、硫胺素、吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛、煙酸、煙酰胺)含量的方法，該方法具有操作步驟簡單、靈敏度高、分離度好、檢測效率高等優(yōu)點，可用于嬰幼兒配方奶粉中B族維生素含量的檢測。

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