朱云鳳

(江蘇省張家港市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科 215600)

金黃色葡萄球菌(SAU)作為常見(jiàn)感染病原菌，普遍存在于日常生活環(huán)境中，常定植于機(jī)體皮膚[1]。隨著近年來(lái)各種抗菌藥物的不斷出現(xiàn)及臨床醫(yī)學(xué)的應(yīng)用，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)逐漸成為醫(yī)院感染和社區(qū)性感染的重要病原菌[2]。MRSA菌株致使各類感染性疾病發(fā)生，包括皮膚性感染、下呼吸道感染、血液類感染等[3]。據(jù)研究顯示，MRSA的耐藥性隨抗菌藥物的應(yīng)用而呈上升趨勢(shì)，且MRSA感染者的比例也逐年增加。由于MRSA常在機(jī)體表面皮膚定植，或出現(xiàn)在不能徹底清理的物體表層，且存活能力較強(qiáng)，而感染后治療過(guò)程困難、復(fù)雜，所以感染后果嚴(yán)重，加上MRSA的耐藥性，住院患者群體是耐藥菌株發(fā)生感染的高頻區(qū)域，因此引起臨床廣泛關(guān)注[4]。為充分了解MRSA感染的來(lái)源分布、感染情況及耐藥性，為醫(yī)院感染提供預(yù)防和控制，指導(dǎo)臨床治療，現(xiàn)對(duì)住院患者M(jìn)RSA進(jìn)行研究，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2015年1月1日至2016年12月31日收治的200例金黃色葡萄球菌感染住院患者，年齡28～65歲，平均(42.13±6.75)歲；男104例，女96例；平均病程(4.07±2.12)年。其中2015年收治患者96例，年齡29～63歲，平均(38.24±6.15)歲；男50例，女46例；平均病程(4.61±4.25)年。2016年收治患者104例，年齡28～65歲，平均(40.16±7.03)歲；男54例，女50例；平均病程(3.45±6.12)年。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡大于18歲，性別不限，長(zhǎng)期住院患者。(2)經(jīng)患者、家屬同意。(3)無(wú)嚴(yán)重心腦血管及軀體疾病，不影響研究進(jìn)程者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)排除近1個(gè)月內(nèi)進(jìn)行重要手術(shù)者(肝臟、心臟等重要器官手術(shù))。(2)排除最近2周使用過(guò)抗菌藥物者。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2儀器與試劑 細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)采用法國(guó)生物梅里埃公司生產(chǎn)的VITEK2 Compact 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀。dNTP、Taq DNA聚合酶、DNA標(biāo)記物、Tris HCl、KCl、MgCl2、Triton X-100均為廣州東盛生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.3方法

1.3.1菌株分離鑒定 依照標(biāo)準(zhǔn)方法采集病原菌標(biāo)本，接種于含有5%羊血的瓊脂培養(yǎng)皿中，35 ℃ 24 h恒溫孵育，根據(jù)菌落具體形態(tài)選擇疑似MRSA的菌落進(jìn)行初步分離，接種于MRSA顯色培養(yǎng)皿。35 ℃ 24 h恒溫孵育，使用全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)菌落進(jìn)行檢測(cè)，藥敏試驗(yàn)判斷菌株類型。

1.3.2藥敏試驗(yàn) 選擇VITEK2 GP67藥敏卡進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)結(jié)合紙片擴(kuò)散法按照美國(guó)《臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)》標(biāo)準(zhǔn)[5]。MRSA使用VITEK2 GP67藥敏卡上機(jī)檢測(cè)，根據(jù)分析儀器的專業(yè)系統(tǒng)制作報(bào)告。

1.3.3紙片擴(kuò)散法 (1)將MRSA培養(yǎng)物均勻涂滿紙板，選取等待檢測(cè)的菌株與滅菌生理鹽水相結(jié)合，制成細(xì)菌混合懸液，涂抹至培養(yǎng)基，保證涂滿且平均分布。(2)使用高溫殺菌的鑷子，把包含抗菌藥物類藥品的過(guò)濾紙分別貼在平板表層，各過(guò)濾紙之間保持一定間隔，可使用鑷子輕壓紙片，讓過(guò)濾紙能與培養(yǎng)基緊貼。培養(yǎng)基正中貼一種抗菌過(guò)濾紙，周?chē)凑胀瑯娱g隔貼數(shù)種其他的抗菌過(guò)濾紙，紙片背面應(yīng)注明藥名。(3)恒溫35 ℃ 24 h培養(yǎng)，然后觀察結(jié)果。

1.3.4隨機(jī)引物聚合酶鏈反應(yīng)法(AP-PCR) 細(xì)菌混合懸液的離心管煮沸加熱5 min，置于3 000 r/min的抗凝管中進(jìn)行離心5 min,提取上清液待檢。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增：總反應(yīng)體系20 mmol/L,pH值9.0的Tris HCl,60 mmol/L KCl,3.5 mmol/L MgCl2,0.01% Triton X-100,0.3 mmol/L dNTPS,60 pmoL 引物，Taq DNA聚合酶0.4 U，模版DNA 60 ng引物；在1.0 mL的離心管中加入以上各類試劑，混合攪拌均勻，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序：預(yù)變性94 ℃ 6 min之后進(jìn)行變性94 ℃ 3min,接著退火25 ℃ 3 min,最后延伸 74 ℃ 2 min,循環(huán)35次。―20 ℃對(duì)DNA擴(kuò)展物進(jìn)行儲(chǔ)存，使用時(shí)將擴(kuò)增物放置在2.0%的瓊脂糖凝膠中，進(jìn)行電泳2 h，電力100 mA，然后借助紫外線燈對(duì)其進(jìn)行觀察并記錄檢測(cè)結(jié)果。

1.4評(píng)價(jià)指標(biāo) (1)SAU及MRSA菌株：按照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)相關(guān)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)和操作規(guī)范進(jìn)行確認(rèn)鑒定[6]。頭孢西丁最小抑菌濃度大于或等于6 μg/mL時(shí)，判定為MRSA菌株。檢測(cè)藥物敏感性時(shí)，如果頭孢西丁紙片的抑制細(xì)菌的圓圈半徑小于10.5 mm，則判定為MRSA。(2)電泳結(jié)果評(píng)定：同型為電泳圖譜一致；亞型為電泳圖譜相差1個(gè)條帶；親緣關(guān)系密切為電泳圖譜相差2～3個(gè)條帶；可能相關(guān)為電泳圖譜相差4～6個(gè)條帶；無(wú)親緣關(guān)系為電泳圖譜相差多于7個(gè)條帶。使用字母A、B、C、D、E、F等按照順序進(jìn)行分型。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1患者M(jìn)RSA分離情況比較 2年患者M(jìn)RSA菌株分離率均較高(84.0%)，其中2015年為83.33%,2016年為84.62%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2MRSA菌株標(biāo)本類型結(jié)果比較 患者M(jìn)RSA菌株主要來(lái)自下呼吸道痰液和外科傷口分泌物，血液和抽取液標(biāo)本極少；各類型標(biāo)本比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.684,P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 MRSA菌株標(biāo)本類型結(jié)果比較(n=168)

2.3患者染色體DNA同源性結(jié)果比較 染色體同源性分為7種圖譜，其中A、B型菌株占主要部分，E、F、G型菌株只占很少部分；各類型比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.162，P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.4MRSA對(duì)不同抗菌藥物的耐藥性結(jié)果比較 MRSA菌株對(duì)復(fù)方磺胺甲噁唑、利福平、莫西沙星的耐藥性較低，對(duì)青霉素和苯唑西林的耐藥性較高，對(duì)慶大霉素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、克林霉素耐藥性較為普通，對(duì)萬(wàn)古霉素、替考拉寧、替加環(huán)素、利奈唑胺未檢測(cè)到耐藥性；各耐藥性之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.432，P<0.05)。見(jiàn)表3。

表2 患者染色體DNA同源性結(jié)果比較(n=168)

表3 MRSA 對(duì)不同抗菌藥物的耐藥性結(jié)果比較(n=168)

3 討 論

伴隨各類抗菌類藥物的不斷應(yīng)用，病原菌的耐藥性增強(qiáng)，特別是多重耐藥性菌株成為臨床面臨的主要難題。MRSA對(duì)住院患者的感染率不斷上升，已成為醫(yī)院感染的主要原因，MRSA引起的感染和艾滋病、乙型肝炎成為臨床三大感染性病癥[7]。住院患者是MRSA的高頻感染區(qū)域，原因是MRSA普遍生存在物體表層和機(jī)體皮膚，且在空氣中大量存在[8]。因住院患者常伴其他疾病，如糖尿病、肺病、腫瘤等，機(jī)體免疫能力低下，對(duì)MRSA感染無(wú)有效防御。此外，住院患者常處于昏迷狀態(tài)，常借助侵襲性治療維持生命體征平穩(wěn)，如靜脈輸液、導(dǎo)管排尿等，這也在一定程度上減弱了機(jī)體對(duì)MRSA的免疫力[9]?；颊哂捎陂L(zhǎng)期使用抗菌類藥物，導(dǎo)致細(xì)菌群落失去平衡，從而為MRSA感染創(chuàng)造條件?；颊吒腥綧RSA后借助空氣和體液等在患者之間，患者和護(hù)理人員之間互相傳播，導(dǎo)致MRSA進(jìn)一步感染。所以MRSA感染的控制和隔離顯得尤其重要，醫(yī)院需提高對(duì)感染患者的管理和監(jiān)督，遏制擴(kuò)散流行。

MRSA感染擴(kuò)散速度很快，且影響后果深遠(yuǎn)，所以如何迅速判定MRSA，對(duì)臨床治療藥物選擇和抑制擴(kuò)散具有重要意義。使用梅里埃VITEK2 Compact 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀，將細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)結(jié)合，分析菌落在不同抗菌藥物培養(yǎng)皿的分離結(jié)果獲得其耐藥性，利用細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行整合、分析、判定MRSA菌株。有研究指出，全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀能快速、準(zhǔn)確地對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分析檢測(cè)，且具備較高的敏感性和特異性，簡(jiǎn)單方便，可作為臨床評(píng)價(jià)MRSA的工具[10]。MRSA分離率具有地域差異，據(jù)2013年相關(guān)醫(yī)學(xué)報(bào)告，中國(guó)MRSA感染平均檢出率為50.6%[11]。本研究結(jié)果表明，MRSA菌株感染總分離率為84.0%，顯著高于國(guó)內(nèi)平均水平，說(shuō)明MRSA菌株感染率逐漸升高。MRSA感染常見(jiàn)部位是下呼吸道、外科手術(shù)創(chuàng)口、導(dǎo)管等。本研究標(biāo)本來(lái)源最多的是下呼吸道痰液，其次是外科傷口分泌物、術(shù)后膿液、尿液，最少見(jiàn)的是靜脈置管、血液、抽取液，提示下呼吸道和外科傷口是MRSA容易發(fā)生感染的區(qū)域。下呼吸道感染和使用呼吸機(jī)存在正相關(guān)關(guān)系，血液感染和靜脈輸液存在正相關(guān)關(guān)系。有關(guān)研究報(bào)道，外科手術(shù)留下的創(chuàng)口和皮膚遭到燒傷而引起的感染也屬于醫(yī)源性感染，更加說(shuō)明MRSA引發(fā)的感染多是外源性感染[12]。治療中使用呼吸機(jī)協(xié)助呼吸或輸液時(shí)進(jìn)行靜脈和動(dòng)脈插管都會(huì)對(duì)免疫屏障造成損壞，導(dǎo)致開(kāi)放性創(chuàng)面的出現(xiàn)，引起各類有害細(xì)菌的侵襲。因此，臨床護(hù)理治療需提高該區(qū)域的監(jiān)督測(cè)評(píng)，并采取消毒殺菌等隔離措施，防止MRSA醫(yī)院感染的大范圍出現(xiàn)。

本研究結(jié)果表明，MRSA對(duì)常用抗菌藥物(復(fù)方磺胺甲噁唑、利福平和莫西沙星等)普通耐藥，對(duì)β-內(nèi)酞胺類抗菌藥物(青霉素和苯唑西林)高度耐藥，對(duì)萬(wàn)古霉素、替考拉寧、替加環(huán)素、利奈唑胺則敏感，MRSA存在多重耐藥性。β-內(nèi)酞胺類抗菌藥物和四環(huán)素類不適合治療感染的常用藥物，但萬(wàn)古霉素、替考拉寧、替加環(huán)素可作為應(yīng)對(duì)感染的藥物。有研究報(bào)道，利奈唑胺對(duì)多重耐藥的細(xì)菌具有良好的抗菌作用，其還具備遏制細(xì)菌耐藥性增長(zhǎng)的功能，且對(duì)肺組織的滲透也具有優(yōu)良的效果，能在一定程度上替代氨基糖苷類抗菌藥物[13]。對(duì)MRSA菌株進(jìn)行染色體同源性分析，發(fā)現(xiàn)A、B型是病房?jī)?nèi)的主要傳播類型，其次是C、D型，說(shuō)明MRSA會(huì)形成同源感染擴(kuò)散，因?yàn)镸RSA在同一型別之內(nèi)容易復(fù)制擴(kuò)散，且排異性差，而常見(jiàn)的醫(yī)院擴(kuò)散方式為經(jīng)手?jǐn)U散傳播，醫(yī)務(wù)人員應(yīng)當(dāng)針對(duì)其擴(kuò)散方式加強(qiáng)檢測(cè)，提高護(hù)理人員的手部衛(wèi)生情況，隔離MRSA感染患者，預(yù)防醫(yī)院感染[14]。

MRSA能引發(fā)多種感染，如皮膚性感染(軟組織感染)、呼吸道感染、血液類感染(敗血癥)、泌尿系統(tǒng)感染，該類感染多發(fā)于體質(zhì)較弱、免疫抵抗力低下、年齡較大、開(kāi)放性手術(shù)創(chuàng)口、經(jīng)常性輸液或大量使用抗菌藥物的患者。護(hù)理人員手部感染、醫(yī)療人員自身攜帶、病房?jī)?nèi)部污染都是MRSA感染的重要因素。若能及時(shí)發(fā)現(xiàn)MRSA感染患者，盡早隔離，準(zhǔn)確有效地治療，醫(yī)護(hù)人員嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)控制，做到無(wú)菌的各類護(hù)理操作、規(guī)范的手部清潔、抗菌藥物的合理使用，那么MRSA感染率便會(huì)大幅度下降。

綜上所述，住院患者的MRSA感染率較高，對(duì)不同抗菌藥物呈多重耐藥性，院內(nèi)流行的MRSA菌株主要是A、B型,需加強(qiáng)對(duì)耐藥菌的檢測(cè)，以及采取消毒隔離等措施對(duì)MRSA感染流行進(jìn)行防控。

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