李 波，王 沈，顏昭勇，張建省，楊 濤，張洪新*，袁 鵬

(1.第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院 疼痛科， 陜西 西安 710038； 2.中國人民解放軍第463醫(yī)院 特診科， 遼寧 沈陽 110042；3.空軍94259部隊衛(wèi)生隊， 山東 蓬萊 265600)

原發(fā)性肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是中國高發(fā)惡性腫瘤之一，雖然近年來隨著以手術(shù)為主，介入治療等多種方法為輔的綜合治療不斷進步，HCC患者的整體生存時間有所增加，但其病死率仍均居高不下[1]。隨著精準醫(yī)療的要求，基于肝細胞肝癌分子分型進行分類治療成為當前HCC治療的基本要求。大量研究表明惡性腫瘤患者的多個生物節(jié)律基因發(fā)生紊亂是常見的現(xiàn)象，并且這種紊亂與腫瘤的惡性生物行為密切聯(lián)系[2]。Per2作為晝夜生物節(jié)律形成中的重要負性調(diào)控因子[3]，可調(diào)控多種基因的轉(zhuǎn)錄，是抑制腫瘤發(fā)生、進展的關(guān)鍵因素[4- 5]。已有研究證實Per2在卵巢癌[6]、頭頸部癌[7]、慢性白血病[8]、胃癌[9]和前列腺癌[10]中表達下調(diào)，上調(diào)其表達能夠顯著抑制腫瘤細胞增殖。Per2在HCC中表達下調(diào)[11]，但其與HCC患者的臨床病理特征、預后及在HCC細胞中的生物學功能均尚不明確。本研究探索了Per2在HCC組織中表達變化，分析其與患者預后的關(guān)系和對細胞生長的影響，以期為HCC的臨床預后判斷和分子靶向治療提供實驗依據(jù)和新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床標本：收集2000—2016年在唐都醫(yī)院接受原發(fā)性肝細胞肝癌手術(shù)切除術(shù)標本117例，所有病例的臨床資料均完整，均經(jīng)病理診斷確診為肝細胞肝癌，所用標本詳細信息見表1。該研究通過唐都醫(yī)院倫理委員會審核批準并取得所有涉及此項研究患者的同意。

1.1.2 細胞及主要試劑：肝癌細胞SMMC- 7721(中國科學院上海細胞庫)；胎牛血清(杭州四季青公司)；RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco公司)；LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)；Per2真核表達質(zhì)粒及對照組質(zhì)粒(Gencopoeia公司)；兔多克隆抗體Per2(Abcam公司和武漢三鷹公司)；兔多抗β-Tubulin抗體(武漢三鷹公司)；羊抗兔二抗(上海碧云天公司)；凋亡檢測試劑盒(上海貝博生物公司)；MTS試劑(Promega公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：在含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37 ℃，5% CO2的條件下培養(yǎng)SMMC- 7721細胞。細胞按4×105個/孔接種于6孔板中，將Per2真核表達質(zhì)粒和LipofectamineTM2000混合后加入到6孔板細胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染后細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.2 免疫組化檢測：肝癌組織病理石蠟切片依序脫蠟，檸檬酸鹽緩沖液進行高壓抗原修復，3% H2O2溶液浸泡15 min，山羊血清28 ℃，封閉20 min。將稀釋好的抗Per2多克隆抗體覆蓋切片，4 ℃，過夜孵育。PBS洗滌3次后加二抗工作液，37 ℃恒溫箱孵育20 min。PBS洗滌3次后加辣根過氧化物酶，28 ℃恒溫箱孵育20 min。PBS搖洗3次，加入DAB顯色5～8 min。蘇木精復染，室溫3 min，1%鹽酸乙醇分化2～3 s。依序脫水、透明和封片。染色結(jié)果判讀：400×視野下隨機選5個不同視野。計算陽性細胞百分比：<5%為0分、5%～25%為1分、26%～50%為2分、51%～75%為3分、76%～100%為4分。細胞著色程度：未染色記為0分、淺黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分。兩個評分結(jié)果相乘得到的分數(shù)為最終該分子的染色得分。

1.2.3 Western blot檢測蛋白水平：經(jīng)轉(zhuǎn)染48 h的Per2過表達質(zhì)粒組和對照質(zhì)粒組肝癌SMMC- 7721細胞，胰蛋白酶消化，裂解液裂解細胞，提取細胞蛋白。10%的SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白樣品，經(jīng)轉(zhuǎn)膜后5%脫脂牛奶封閉1 h，加Per2的一抗，4 ℃孵育過夜。TBST漂洗3次，二抗室溫孵育2 h，TBST漂洗3次，ELC顯色。

1.2.4 MTS法檢測細胞增殖：96孔板鋪種SMMC- 7721細胞，每孔加培養(yǎng)基100 μL，每組設(shè)置5個復孔，同時設(shè)置只加培養(yǎng)基無細胞的空白對照組。96孔板每孔加20 μL的MTS試劑，細胞培養(yǎng)箱孵育2 h后在490 nm波長下檢測細胞的吸光度值。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡：胰蛋白酶消化6孔板SMMC- 7721細胞，預冷PBS洗滌細胞2次，500 μL結(jié)合液重懸細胞，調(diào)整細胞至1×106個/mL。細胞懸液中加入5 μL的ANXA5-FITC和5 μL的PI染料，充分混勻，4℃避光孵育15 min。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 Per2在HCC組織的表達情況

117例HCC組織中，Per2表達陽性率為70.94%，顯著低于對應癌旁肝組織的87.18%。癌組織中Per2染色評分為2.14±1.76，顯著低于癌旁肝組織的6.39±3.84(P<0.01)(圖1)。

圖1 Per2在肝癌組織和癌旁組織中的表達Fig 1 Expression level of Per2 in HCC tissues and adjacent tissues(×400)

2.2 HCC患者Per2的表達高低與患者臨床病理特征的相關(guān)性分析

將117例HCC患者按照Per2免疫組化評分結(jié)果分為低表達Per2組和高表達Per2組。Per2表達與HCC患者的腫瘤直徑、門脈侵襲和TNM分期相關(guān)(P<0.05)(表1)。

表1 Per2表達水平與HCC患者臨床特征的相關(guān)性

Abbreviations: HBsAg.hepatitis B surface antigen; AFP.α-fetoprotein; PVTT.portal vein tumor thrombosis; TNM.tumor nodes metastases.

2.3 Per2表達與肝細胞肝癌預后的關(guān)系

Per2低表達的患者總體生存期(overall survival, OS)和無復發(fā)生存期(recurrence-free survival, RFS)較Per2高表達的患者短(P<0.05)(圖2)。

2.4 Per2影響肝癌SMMC- 7721細胞增殖

轉(zhuǎn)染Per2真核表達質(zhì)粒組Per2相對蛋白表達為2.76±0.47， 顯著高于轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒組Per2相對蛋白表達1.10±0.30(P<0.01)。在SMMC- 7721細胞中轉(zhuǎn)染Per2真核表達質(zhì)粒可滿足后續(xù)細胞功能試驗研究的需求(圖3)。

EV.control plasmids; Per2.Per2 eukaryoticexpression plasmid圖3 Western blot檢測各組細胞蛋白表達Fig 3 Expression of proteins in groups were measured by Western blot

與轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒組相比，轉(zhuǎn)染Per2真核表達質(zhì)粒組細胞增殖顯著受到抑制，轉(zhuǎn)染后第3天，Per2過表達組吸光度為0.501±0.063，顯著低于對照組的0.812±0.060(P<0.01)(圖4)。

EV.control plasmids; Per2.Per2 eukaryotic expression plasmid; *P< 0.01 compared with EV groups圖4 Per2對肝癌SMMC- 7721細胞增殖的影響Fig 4 Effect of Per2 on proliferation of SMMC- 7721

2.5 Per2對肝癌SMMC- 7721細胞凋亡分析

過表達Per2組細胞凋亡百分比為22.83±2.27，顯著高于對照組的10.63±1.62(P<0.01)(圖5)。

EV.control plasmids; Per2.Per2 eukaryotic expression plasmid圖5 Per2對肝癌SMMC- 7721細胞凋亡的影響Fig 5 Effect of Per2 on apoptosis of SMMC- 7721 cells

3 討論

近年來，Per2作為新的候選抑癌基因已在多種惡性腫瘤組織中被發(fā)現(xiàn)其表達下調(diào)，且與腫瘤進展和患者預后相關(guān)。在本研究117例肝癌病例中，癌組織Per2表達陽性率顯著低于癌旁肝組織中表達陽性率，而Per2免疫組化評分癌組織中Per2染色評分僅為癌旁肝組織Per2染色評分的30%。同時本研究在4個肝癌公共數(shù)據(jù)(GSE14520、GSE22058、GSE25097、TCGA)共計622例HCC中發(fā)現(xiàn)，癌組織中Per2的mRNA表達同樣顯著降低(結(jié)果未展示)。該結(jié)果與既往Per2在其他腫瘤中的表達情況相一致，也與在中國臺灣地區(qū)46例HCC患者和貴陽地區(qū)40例HCC患者中Per2在癌組織中表達水平顯著下降的結(jié)果一致[11- 12]。

目前臨床缺乏早期診斷HCC和HCC完全切除術(shù)后判斷預后的有效生物學指標，造成患者在就診時已處于中晚期，而在手術(shù)后腫瘤易復發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，尋找有效反映HCC復發(fā)、轉(zhuǎn)移的分子標志物成為精準醫(yī)療的當務之急。本研究發(fā)現(xiàn)Per2表達與腫瘤直徑、門脈侵襲和TNM分期等因素相關(guān)，Per2低表達的患者總體生存期和無復發(fā)生存期均較Per2高表達的患者短。上述結(jié)果表明Per2有望作為肝癌獨立預后判斷指標，下一步需擴大病例樣本進行驗證。

目前對于Per2發(fā)揮抑癌作用及機制尚未完全清楚。研究顯示，Per2參與包括細胞增殖、周期、凋亡和轉(zhuǎn)移等多項調(diào)控，如前列腺癌細胞中過表達Per2會抑制細胞增殖和存活[10]?？谇涣谞畎┘毎懈缮鍼er2，細胞周期相關(guān)分子cyclinA2、cyclinB1、cyclinD1、CDK4、CDK6和E2F1增加，而p53、p16和p21減少，G1/G0期細胞減少，細胞凋亡減少[13]。在X線誘導U343膠質(zhì)瘤細胞DNA凋亡模型中，干涉Per2會減少DNA損傷和細胞死亡，Per2通過增加P53活性和表達來抑制腫瘤細胞增殖、DNA損傷修復及增加凋亡[4]。乳腺癌中Per2缺失會增強EMT及相關(guān)蛋白表達[14]。本研究中過表達Per2會顯著抑制肝癌SMMC- 7721細胞增殖和促進細胞凋亡，這與Per2表達和HCC患者腫瘤直徑成負相關(guān)性二者較一致。

下一步研究需深入探討Per2抑制HCC細胞增殖的具體分子機制，從而為以Per2為靶標的肝癌早期診斷、術(shù)后復發(fā)監(jiān)測以及分子靶向治療提供新的理論支持。

[1] Budny A, Kozlowski P, Kaminska M,etal. Epidemiology and risk factors of hepatocellular carcinoma [J]. Pol Merkur Lekarski, 2017, 43: 133- 139.

[2] Shostak A. Circadian clock, cell division, and cancer: from molecules to organism [J]. Int J Mol Sci, 2017, 18: 873- 888.

[3] Sahar S, Sassone-Corsi P. Metabolism and cancer: the circadian clock connection [J]. Nat Rev Cancer, 2009, 9: 886- 896.

[4] Niu ZF, Wang CQ, Xia HC,etal. Period2 down-regulation inhibits glioma cell apoptosis by activating the MDM2-TP53 pathway [J]. Oncotarget, 2016, 7: 27350- 27362.

[5] Lee S, Donehower Lawrence A, Herron Alan J,etal. Disrupting circadian homeostasis of sympathetic signaling promotes tumor development in mice [J]. PLoS One, 2010, 5: e10995. doi: 10.1371./journal.pone.0010995.

[6] Tokunaga H, Takebayashi Y, Utsunomiya H,etal. Clinicopathological significance of circadian rhythm-related gene expression levels in patients with epithelial ovarian cancer [J]. Acta Obstet Gynecol Scand, 2008, 87: 1060- 1070.

[7] Hsu CM, Lin SF, Lu CT,etal. Altered expression of circadian clock genes in head and neck squamous cell carcinoma [J]. Tumour Biol, 2012, 33: 149- 155.

[8] Yang MY, Chang JG, Lin PM,etal. Downregulation of circadian clock genes in chronic myeloid leukemia: alternative methylation pattern of hPER3 [J]. Cancer Sci, 2006, 97: 1298- 1307.

[9] Zhao H, Zeng ZL, Yang J,etal. Prognostic relevance of Period1 (Per1) and Period2 (Per2) expression in human gastric cancer [J]. Int J Clin Exp Pathol, 2014, 7: 619- 630.

[10] Jung-Hynes B, Huang W, Reiter Reiter J,etal. Melato-nin resynchronizes dysregulated circadian rhythm circuitry in human prostate cancer cells [J]. J Pineal Res, 2010, 49: 60- 68.

[11] Lin YM, Chang JH, Yeh KT,etal. Disturbance of circadian gene expression in hepatocellular carcinoma [J]. Mol Carcinog, 2008, 47: 925- 933.

[12] Yang SL, Yu C, Jiang JX,etal. Hepatitis B virus X protein disrupts the balance of the expression of circadian rhythm genes in hepatocellular carcinoma [J]. Oncol Lett, 2014, 8: 2715- 2720.

[13] Wang QQ, Ao YR, Yang K,etal. Circadian clock gene Per2 plays an important role in cell proliferation, apopto-sis and cell cycle progression in human oral squamous cell carcinoma [J]. Oncol Rep, 2016, 35: 3387- 3394.

[14] Hwang-Verslues WW, Chang PH, Jeng YM,etal. Loss of corepressor PER2 under hypoxia up-regulates OCT1-mediated EMT gene expression and enhances tumor malignancy [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013, 110: 12331- 12336.

新聞點擊

睡眠呼吸暫停面罩無法遏止心臟病風險

據(jù)美國WebMD醫(yī)學新聞網(wǎng)(2016- 09- 04)報道，由于阻塞性睡眠呼吸暫停而造成的晚上呼吸困難曾長期被認為是心血管風險增加的原因。然而，最近的一篇研究讓人們對這個關(guān)聯(lián)性產(chǎn)生困惑。用持續(xù)性正壓呼吸器(CPAP)治療可以減輕睡眠呼吸暫停的癥狀，但它無法降低使用者長期的心臟病發(fā)作、腦卒中或心臟相關(guān)死亡的概率。

CPAP是持續(xù)性正壓呼吸器，使用者在晚上睡覺時戴上它，讓他們呼吸較為順暢。

然而，CPAP療法難以堅持，據(jù)這篇研究報道，人們每晚使用CPAP的時間平均只有3 h。

研究結(jié)果顯示，無論是否使用CPAP，心臟相關(guān)死亡、心臟病發(fā)作、腦卒中、短暫缺血性發(fā)作等的發(fā)病率并沒有差異。

為何CPAP對心臟健康沒有益處？Doug McEvoy博士認為，以前的觀察性研究可能高估了睡眠呼吸暫停與心血管疾病之間的關(guān)聯(lián)，如果這個關(guān)聯(lián)性比想象的弱，那么阻斷睡眠呼吸暫停對心臟的益處就不會那么大了。

McEvoy博士認為，出現(xiàn)這個研究結(jié)果的原因還可能是因為有許多參與者每晚只使用CPAP 3 h，或許還沒有長到足以帶給心臟益處。

吸煙與克隆病術(shù)后復發(fā)風險有關(guān)

據(jù)美國WebMD醫(yī)學新聞網(wǎng)(2016- 09- 09)報道，有新的研究顯示，吸煙增加了克隆病患者腸手術(shù)后的復發(fā)風險。

這篇研究包括了英國240名克隆病患者，于他們進行腸手術(shù)后追蹤3年；研究者指出，克隆病發(fā)生于免疫系統(tǒng)攻擊腸道內(nèi)膜，引起嚴重炎性反應，可能會導致腹瀉、腹痛、惡心與食欲降低。

一開始通常會使用抑制免疫系統(tǒng)的藥物治療這類患者，但是，研究人員認為，超過半數(shù)的克隆病患者最后進行了手術(shù)移除受感染的腸段，然而，手術(shù)無法根治克隆病，常會復發(fā)。

愛丁堡大學的研究者認為，吸煙者比不吸煙者更容易在術(shù)后復發(fā)。

研究者還評估了稱為硫嘌呤的這類藥物(如mercaptopurine，商品名 Purinethol與Purixan)是否可有效預防術(shù)后復發(fā)。研究發(fā)現(xiàn)，這類常被用于治療克隆病的藥物確實可降低吸煙者的復發(fā)風險，但是不適用于非吸煙者。

研究人員認為，研究結(jié)果提示吸煙的克隆病患者在術(shù)后應立即給予硫嘌呤類藥物，但對于非吸煙者并無證據(jù)支持使用這些藥物。

研究作者Jack Satsangi認為，他們的研究確認了對克隆病患者健康有益的一件重要事情：不要吸煙。

Satsangi指出，對于進行腸手術(shù)的非吸煙者，第一年的最佳方法是密切觀察，而非立即給予藥物治療。

這篇研究發(fā)表于2016- 08- 30《柳葉刀·胃腸肝病學》。