李明珠，劉麗喬，劉卓琦，王 群

(南昌大學(xué) 1.第一臨床醫(yī)學(xué)院； 2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室； 3.第一附屬醫(yī)院 心胸外科，江西 南昌 330006)

冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)是外科治療心血管疾病的重要手段[1]。自體大隱靜脈是手術(shù)最常見(jiàn)的選擇[2]，但其遠(yuǎn)期通暢率并不理想，術(shù)后1年有超過(guò)20%的靜脈出現(xiàn)再狹窄，該比例在術(shù)后10年提升至60%[3]。臨床上主要用2類抗增殖劑來(lái)預(yù)防再狹窄：雷帕霉素靶蛋白抑制劑和紫杉醇及其衍生[4]。

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白 (mammalian target of rapamycin, mTOR) 是生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子下游的主要信號(hào)傳導(dǎo)通路，參與調(diào)控細(xì)胞存活、增殖和分化；其存在兩種結(jié)構(gòu)和功能不同的多蛋白復(fù)合物mTORC1和mTORC2[5]，兩者的活性分別由特異性輔助因子(包括Raptor和Rictor)調(diào)節(jié)[6]。它們對(duì)mTOR抑制劑的敏感程度不同是長(zhǎng)期使用mTOR抑制劑導(dǎo)致不良反應(yīng)的主要原因之一[7]，靶向抑制mTOR通路是提高再狹窄治療效果和減輕毒性反應(yīng)的新思路。

小型酚類化合物白藜蘆醇(resveratrol, Res)廣泛存在于葡萄、花生和藜蘆等多種植物中，因其天然無(wú)毒等特點(diǎn)，近年來(lái)頗受中老年慢性病患者的青睞，在食品、藥品及保健品領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。白藜蘆醇還具有心血管保護(hù)功能[8- 9]，有望成為一種對(duì)抗移植物再狹窄的備選藥物[10]。本研究以腺病毒為載體，介導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Rictor基因過(guò)表達(dá)，觀察白藜蘆醇對(duì)HUVECs增殖、遷移及體外管腔形成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

白藜蘆醇(純度99%，Sigma公司)；用DMSO溶解配成100 mmol/L的原溶液, -20 ℃避光保存，實(shí)驗(yàn)前以RPMll640培養(yǎng)液稀釋至使用濃度50 μmol/L；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(ATCC公司)；GV341載體體系、HEK 293T細(xì)胞系和TOP10感受態(tài)細(xì)胞(上海吉?jiǎng)P公司)；pBHG lox ΔE1,3 Cre(Microbix公司)；限制性核酸內(nèi)切酶(NEB公司)；Taq DNA多聚酶(Sinobio公司)；LipofectamineTM2000 (Invtrogen公司)；In-FusionTMPCR 克隆試劑盒(Clontech公司)；兔抗人Rictor單克隆抗體(CST公司)；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鼠抗兔和兔抗鼠抗體(Santa Cruz公司)；CCK- 8試劑盒(日本同仁公司)。

1.2 方法

1.2.1 Rictor重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建：利用cDNA文庫(kù)，參照人源Rictor (NM_152756) 基因序列相關(guān)信息設(shè)計(jì)PCR引物，Rictor-P1:5′-AGGTCGACTCTAGA GGATCCCGCCACCATGGCGGCGATCGGCCGCGGCC GCTCTCTGAAGAACC-3′；Rictor-P2:5′-TCCTTGTA GTCCATACCGGATTCAGCAGATGTATCAACTATAGG TTGCTTTGGTG-3′。利用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂凝膠電泳回收目的基因片段。BamHⅠ/AgeⅠ雙酶切回收的DNA片段與GV314載體(圖1A)，用In-fusionTM PCR克隆反應(yīng)體系，42 ℃ 15 min連接。產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)抗性克隆進(jìn)行測(cè)序分析，將正確克隆菌液擴(kuò)大培養(yǎng)、抽提。

圖1 GV314載體(A)和輔助包裝質(zhì)粒(B)圖譜 Fig 1 Profiles of vector GV314 (A) and helper plasmid (B)

1.2.2 重組腺病毒載體的包裝、擴(kuò)增：用AdMax腺病毒包裝體系，將上述重組質(zhì)粒與輔助包裝質(zhì)粒pBHG lox ΔE1, 3 Cre(圖1B)混合，通過(guò)脂質(zhì)體試劑LipofectamineTM2000共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，用Cre/loxP重組酶切割系統(tǒng)獲得重組腺病毒。293T細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染前2 h更換為無(wú)血清培養(yǎng)基，后與DNA/ LipofectamineTM2000復(fù)合液混合，培養(yǎng)6 h后更換為完全培養(yǎng)基。約10 d大部分細(xì)胞出現(xiàn)病變效應(yīng)，經(jīng)-70 ℃/37 ℃反復(fù)凍融，收集重組腺病毒初始液重復(fù)感染293T細(xì)胞2次，按照純化試劑盒的步驟收集病毒，命名為Ad-Rictor(pAV-MCMV/Rictor-GFP- 3FLAG)。陰性對(duì)照組Ad-Null(pAV-MCMV/-GFP)構(gòu)建方法同上。

1.2.3 Rictor過(guò)表達(dá)腺病毒感染HUVECs：常規(guī)培養(yǎng)HUVECs，選擇對(duì)數(shù)增殖期的細(xì)胞分別用Ad-Null和Ad-Rictor感染，48 h后通過(guò)熒光顯微鏡觀察空細(xì)胞、Ad-Null及Ad-Rictor感染的細(xì)胞；提取各組細(xì)胞的總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉，以1∶1 000比例加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗以1∶5 000濃度室溫孵育2 h。以GAPDH為內(nèi)參抗體，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 檢測(cè)白藜蘆醇干預(yù)對(duì)HUVECs生物學(xué)行為影響：實(shí)驗(yàn)分為正常細(xì)胞對(duì)照組(control)、空載體陰性對(duì)照組(Ad-Null)、Rictor過(guò)表達(dá)組(Ad-Rictor)和白藜蘆醇干預(yù)組(Ad-Rictor+Res)。

CCK- 8試劑盒檢測(cè)HUVECs增殖活力。細(xì)胞按照實(shí)驗(yàn)分組接種于96孔板(1.0×104個(gè)細(xì)胞/ mL)常規(guī)孵育24 h，每孔加入10 μL CCK8試劑。酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm光波處的每孔吸光度值A(chǔ)，各重復(fù)孔取均值。

劃痕檢測(cè)HUVECs遷移能力。取對(duì)數(shù)期HUVECs制備細(xì)胞懸液(稀釋濃度約8×104個(gè)/mL)接種于6孔板，待細(xì)胞增殖至90%匯合以上，用微量移液器槍頭均勻地在每孔中十字劃線，洗凈死細(xì)胞后加入等體積含或不含白藜蘆醇的培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)動(dòng)態(tài)檢測(cè)24 h。

體外成管實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HUVECs管腔形成能力。24孔板預(yù)冷，每孔加入200 μL液化的Matrigel膠，平衡20 min后凝固備用。取對(duì)數(shù)期細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞板計(jì)數(shù)后加或不加白藜蘆醇，并稀釋細(xì)胞約5×104個(gè)/mL；鋪好膠的24孔板每孔加入800 μL細(xì)胞懸液，常規(guī)培養(yǎng)48 h后拍照。每孔分別取5個(gè)部位(上、下、左、右及中間)拍照計(jì)算成管數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 目的基因Rictor擴(kuò)增結(jié)果

PCR產(chǎn)物電泳圖可見(jiàn)一約5 168 bp的特異性條帶，與目的基因Rictor一致(圖2)。

1.DNA ladder; 2.DNA fragment圖2 Rictor基因克隆電泳圖Fig 2 Amplification of Rictor gene

2.2 重組腺病毒感染HEK 293T細(xì)胞

熒光顯微鏡觀察，被感染的細(xì)胞可檢測(cè)到綠色熒光蛋白發(fā)出的熒光，說(shuō)明Rictor過(guò)表達(dá)腺病毒載體構(gòu)建成功，感染效率較高(圖3)。

2.3 重組腺病毒感染HUVECs并上調(diào)Rictor蛋白表達(dá)

熒光顯微觀察HUVECs發(fā)現(xiàn)大量被Ad-Null和Ad-Rictor感染的細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，而對(duì)照組未檢測(cè)到熒光(圖4)。Ad-Rictor組在相對(duì)分子質(zhì)量200 ku處可見(jiàn)顯著的Rictor蛋白表達(dá)條帶; 而對(duì)照組、Ad-Null組蛋白條帶均表達(dá)微弱(圖5)。

圖3 熒光顯微鏡觀察Ad-Rictor感染293T細(xì)胞Fig 3 Fluorescent microscopy of 293T cells infected with Ad-Rictor

圖4 Ad-Rictor感染HUVECs的熒光鑒定Fig 4 Fluorescence identification of HUVECs infected with Ad-Rictor

圖5 各組Rictor蛋白表達(dá)情況Fig 5 Protein expression of Rictor between groups

2.4 各組HUVECs細(xì)胞增殖情況比較

CCK- 8結(jié)果顯示，Ad-Rictor組細(xì)胞增生數(shù)量明顯高于對(duì)照組和Ad-Null組(P<0.05)；而Ad-Rictor+Res細(xì)胞數(shù)量不僅明顯低于Ad-Rictor組(P<0.05)，與對(duì)照組相比也有降低(P<0.05)(圖6)。

*P<0.05 compared with control group; △P<0.05 compared with Ad-Rictor group圖6 各組HUVECs細(xì)胞增殖情況Fig 6 Proliferation activities of HUVECs between

2.5 各組HUVECs細(xì)胞遷移能力比較

劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，Ad-Rictor組遷移距離與對(duì)照組相比有顯著增強(qiáng)；Ad-Rictor+Res組細(xì)胞定向遷移能力比Ad-Rictor組有明顯降低(P<0.05)，與對(duì)照組和Ad-Null組差異不大(圖7)。

2.6 各組HUVECs細(xì)胞體外管腔形成能力比較

血管生成實(shí)驗(yàn)顯示，相比于對(duì)照組和Ad-Null組，Ad-Rictor組成形管腔數(shù)量明顯增高 (P<0.05)；Ad-Rictor+Res組成形管腔數(shù)量顯著低于Ad-Rictor組 (P<0.05)(圖8)。

3 討論

旁路移植手術(shù)是閉塞性動(dòng)脈疾病最常用的血運(yùn)重建技術(shù)，短期內(nèi)非常有效，但靜脈移植物長(zhǎng)期暴露于動(dòng)脈環(huán)境會(huì)引起結(jié)構(gòu)性血管壁重塑和內(nèi)膜增厚，移植術(shù)后早期的不良靜脈重塑是移植再狹窄的重要病理基礎(chǔ)[3]。課題組在前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上尋找基因的突破口，發(fā)現(xiàn)mTOR2參與了靜脈移植物的早期重塑，表現(xiàn)為此通路中Rictor基因表達(dá)增強(qiáng)，這是在正常靜脈中看不到的[11]。相對(duì)于mTORC1，對(duì)雷帕霉素不敏感的mTORC2對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用更為關(guān)鍵[6]；敲除mTORC2的重要組成部分Rictor可以明顯抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成，但不影響mTORC1信號(hào)通路[6,12]。

A.cell wound scratch assay; B.analysis of migration distance in each group圖7 各組HUVECs的遷移能力Fig 7 Migration of HUVECs between n=3)

A.microscopic observation of tubular structure(×200); B.the analysis of the number in each group;*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with Ad-Rictor group

本實(shí)驗(yàn)靶向mTORC2通路構(gòu)建Rictor過(guò)表達(dá)腺病毒載體，使其感染研究對(duì)象HUVECs。觀察到Ad-Null和Ad-Rictor均具有較高的感染效率，其中在HUVECs的感染效率可達(dá)89%；Ad-Rictor能成功上調(diào)重組蛋白R(shí)ictor表達(dá)水平，說(shuō)明過(guò)表達(dá)Rictor腺病毒載體構(gòu)建成功。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)HUVECs的增殖、遷移和血管形成能力隨之顯著增強(qiáng)，進(jìn)一步證明Rictor是調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)行為的關(guān)鍵因子。

本研究構(gòu)建的Ad-Rictor體外模擬了靜脈重塑中內(nèi)皮細(xì)胞的Rictor過(guò)表達(dá)狀態(tài)，后加入白藜蘆醇的干預(yù)，發(fā)現(xiàn)HUVECs的增殖率、體外遷移距離和管腔形成數(shù)量均下降。白藜蘆醇對(duì)AMPK/mTOR信號(hào)通路的調(diào)節(jié)在其他細(xì)胞中已得到驗(yàn)證[13- 14]，本研究證明了白藜蘆醇對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用亦與mTOR2通路有關(guān)，表現(xiàn)為抑制內(nèi)皮細(xì)胞在Rictor過(guò)表達(dá)狀態(tài)下的過(guò)度增殖、遷移以及血管形成能力。

綜上所述，白藜蘆醇可以靶向mTORC2/Rictor抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及管腔形成能力，提示白藜蘆醇可抑制靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增生和血管異生，有望成為一種有效預(yù)防移植后再狹窄并避免全身毒性反應(yīng)的天然藥物，為改善旁路移植術(shù)后長(zhǎng)期結(jié)局提供新的治療思路。

[1] Weintraub WS, Grau-Sepulveda MV, Weiss JM,etal. Comparative effectiveness of revascularization strategies[J]. New England J Med, 2012, 366:1467- 1476.

[2] Shuhaiber JH, Evans AN, Massad MG,etal. Mech-anisms and future directions for prevention of vein graft failure in coronary bypass surgery[J]. Eur J Cardiothorac Surg, 2002, 22:387- 396.

[3] de Vries MR, Simons KH, Jukema JW,etal. Vein graft failure: from pathophysiology to clinical outcomes[J]. Nat Rev Cardiol, 2016, 13:451- 470.

[4] Habib A,Finn AV. Antiproliferative drugs for restenosis prevention[J]. Interv Cardiol Clin, 2016, 5:321- 329.

[5] Kurdi A, De Meyer GR,Martinet W. Potential therapeutic effects of mTOR inhibition in atherosclerosis[J]. Br J Clin Pharmacol, 2016, 82:1267- 1279.

[6] Wang S, Amato KR, Song W,etal. Regulation of endothelial cell proliferation and vascular assembly through distinct mTORC2 signaling pathways[J]. Mol Cell Biol, 2015, 35:1299- 1313.

[7] 劉麗喬,王群. mTOR抑制劑抗動(dòng)脈粥樣硬化的研究進(jìn)展[J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2017,37:265- 269.

[8] Chen ML, Yi L, Jin X,etal. Absorption of resveratrol by vascular endothelial cells through passive diffusion and an SGLT1-mediated pathway[J]. J Nutr Biochem, 2013, 24:1823- 1829.

[9] Xia N, Forstermann U,Li H. Resveratrol and endothelial nitric oxide[J]. Molecules, 2014, 19:16102- 16121.

[10] Zhu Y, Takayama T, Wang B,etal. Restenosis inhibi-tion and re-differentiation of TGFbeta/Smad3-activated smooth muscle cells by resveratrol[J]. Sci Rep, 2017, 7:41916.

[11] Wang Q, Wan L, Liu L,etal. Role of the mTOR signalling pathway in experimental rabbit vein grafts[J]. Heart Lung Circ, 2016, 25:1124- 1132.

[12] Zheng NN, Ding XD,Zhang HP. Targeting rictor inhibits mouse vascular tumor cell proliferation and invasioninvitroand tumor growthinvivo[J]. Neoplasma, 2013, 60:41- 45.

[13] Tillu D, Melemedjian OK, Asiedu M,etal. Resveratrol engages AMPK to attenuate ERK and mTOR signaling in sensory neurons and inhibits incision-induced acute and chronic pain[J]. Mol Pain, 2012, 8:5- 13.

[14] Qin N, Wei L, Li W,etal. Local intra-articular injection of resveratrol delays cartilage degeneration in C57BL/6 mice by inducing autophagy via AMPK/mTOR pathway[J]. J Pharmacol Sci, 2017, 134:166- 174.