黃偉偉，李紹軍，高梅，張斌

（西北農林科技大學 生命科學學院，陜西楊凌 712100）

染色質是細胞遺傳密碼的物質載體，也是細胞代謝和遺傳活動的調控基礎。染色體制備技術是細胞生物學及遺傳學的核心基礎技術之一，綜合院校的細胞生物學實驗課程大都包含染色體制備實驗。然而染色體制備技術復雜，操作環(huán)節(jié)多，耗時長，影響因素多，在實際實施過程中獲得理想染色體的成功率很低，因此需要進一步改進優(yōu)化，提高成功率，使學生能夠真正掌握染色體標本的制備技術，了解染色體的數目以及形態(tài)特征[1]。染色體只出現在分裂期的細胞中，以分裂中期的染色體結構最為典型，因此要想獲得理想的染色體標本，前提是獲得足夠的分裂中期細胞。目前，運用最廣泛的方法是體外培養(yǎng)外周血細胞，利用植物凝集素（PHA）刺激淋巴細胞進入有絲分裂，培養(yǎng)72 h后，再用秋水仙素處理使細胞周期停滯在分裂中期，再經低滲、固定、滴片等處理，獲得可用染色體標本。外周血培養(yǎng)法雖然能夠獲得大量的分裂中期細胞，然而需要進行細胞無菌培養(yǎng)，而且實驗耗時較長、風險較大，不便于在教學實驗中開展。動物機體內的骨髓和睪丸細胞分裂比較旺盛，所以小鼠骨髓或睪丸是實驗教學中制備染色體較為理想的實驗材料。本文比較了利用小鼠骨髓和睪丸細胞制備染色體的優(yōu)劣，并討論了染色體制備過程中的注意事項和改進方法。

1 秋水仙素處理

為獲得較多的分裂中期細胞，通常利用秋水仙素能夠結合微管并阻止微管組裝的特性，實驗前給實驗小鼠注射一定量的秋水仙素，促使骨髓和睪丸中的分裂細胞停滯在分裂中期。實驗小鼠一般選擇2～3月齡達到體成熟的昆白鼠，秋水仙素配制為1 mg/mL溶液，一般按照4～6μg/g BW的劑量進行腹腔注射，3～4 h后采用脫臼法處死小鼠，分離細胞。

2 細胞分離

2.1 骨髓細胞分離

剪開小鼠腹部和后腿皮膚，從髖關節(jié)處切開，分離后腿，剝離股骨和脛骨上的肌肉組織，取得完整股骨和脛骨，切去兩端，暴露骨腔；用1 mL注射器吸取2%檸檬酸鈉溶液，通過針頭將溶液注入骨腔中，將骨髓細胞沖至10 mL離心管中，反復沖洗骨腔，直至骨髓腔由粉紅變?yōu)榘咨?，以盡可能多地分離獲得骨髓細胞；摘掉針頭，用注射器輕輕反復吸打細胞懸液，將細胞團塊分散為單個細胞。

2.2 睪丸細胞分離

剪開小鼠腹部，暴露腹腔，沿著輸精管查找小鼠睪丸；剪下睪丸，轉移至小燒杯中，剪碎；加入3 mL 2%檸檬酸鈉溶液，用玻璃棒進一步搗碎；再用膠頭滴管反復吹打均勻，用鑷子挑出大的組織團塊；用注射器取1 mL細胞懸液轉移至10 mL離心管中。

3 染色體制備

3.1 低滲處理

向離心管中加入8 mL預熱的0.4% KCl溶液（0.075 mol/L），在37℃水浴鍋中低滲處理30 min。

3.2 預固定

向離心管中滴加新配制的甲醇-冰醋酸固定液1mL，用吸管輕輕吹打1～2 min混勻，1 000 r/min離心8 min，棄去上清。

3.3 固定

加入5 mL新配制的固定液，用吸管輕輕吹打混勻，室溫靜置10 min。1 000 r/min離心8 min，棄去上清。重復固定2～3次。

3.4 滴片

固定好的細胞經離心后，吸去上清，視細胞量殘留0.5～1 mL固定液，輕輕吸打形成單細胞懸液。取出干凈并預冷的載玻片，以一定垂直高度滴加細胞懸液，風干或者酒精燈烘干。

3.5 染色

將滴加有細胞的載玻片細胞面朝上水平放置，滴加1∶10 Giemsa染液3～4 mL，染色10 min，流水沖洗掉染液，干燥后鏡檢。

4 結果觀察

低倍鏡下觀察細胞分散轉態(tài)和細胞分布，選擇形態(tài)清晰、分散良好、背景干凈的中期分裂相染色體，用油鏡細致觀察。理想的中期分裂相染色體形態(tài)應為染色體集中分布，每條染色體結構清晰，長度適中，形態(tài)一般程“U”形，著絲粒位置清楚，數目為2n=40，染色效果好，無染色體纏繞，重疊現象。

5 骨髓和睪丸細胞制備染色體優(yōu)劣比較

5.1 骨髓細胞

骨髓細胞是機體中分裂比較活躍的細胞，是制備染色體標本較好的細胞來源。利用骨髓細胞制備染色體標本，可以觀察有絲分裂中期體細胞染色體的形態(tài)結構。然而，為獲得骨髓細胞，需要對小鼠進行深度解剖，如果學生缺乏解剖學知識，在分離股骨和脛骨過程中會耗費大量時間；而且在解剖過程中由于氣味和出血，會使學生尤其是女生產生厭惡心理而不愿意動手；此外，解剖操作不熟練往往導致分離的股骨不完整，致使沖洗得到的骨髓細胞數量較少，由于中期分裂相比例很小，進而導致染色體制備成功率低，制片后觀察耗費時間長，找到中期分裂相染色體比較困難。

5.2 睪丸細胞

在雄性小鼠性成熟后，睪丸中的精母細胞不斷分裂分化，也是制備染色體標本較好的細胞來源，可以觀察減數分裂不同階段生殖細胞染色體的形態(tài)結構。睪丸的解剖分離相對比較容易；此外，睪丸體積較大，破碎后會得到細胞數量相對較多，因此利用睪丸細胞制備染色體的成功率相對較高。但實驗過程中只是通過機械剪切的方式破碎睪丸，細胞的分離往往不夠徹底，殘留的組織團塊較多，會對后續(xù)的染色體制備和觀察產生負面影響，因此，在睪丸破碎后最好用細胞篩網進行過濾，甚至可以利用擦鏡紙進行過濾，以除去殘留的組織塊。

通過比較骨髓細胞和睪丸細胞制備染色體的優(yōu)劣，發(fā)現睪丸細胞更有優(yōu)勢，其操作簡單，耗時較短，細胞數目多，成功率高。然而，在實際實驗教學中，可以同時利用骨髓細胞和睪丸細胞進行染色體的制備，一方面可以充實實驗內容，提高實驗趣味性；另一方面還可以讓學生比較兩種細胞的染色體的差異，加深學生對有絲分裂和減數分裂的認識。

6 染色體制備方法改進和注意事項

在實際教學實驗中，學生制備的染色體標本結果通常是成功率很低，鏡檢看到的是數目較多的間期細胞，中期分裂相很少，染色體分散性差，形態(tài)結構不典型[1]。因此，除了選擇合適的細胞材料，還需要做好以下幾個關鍵環(huán)節(jié)的處理，才能得到理想的中期染色體。

6.1 分裂中期細胞獲取

中期分裂相細胞的數量和質量是成功制備染色體的基礎。中期分裂相細胞的數量和質量可以從3個方面進行控制：（1）小鼠質量，一般應選擇2～3月齡體成熟的雄性昆白鼠，體重應在25～35 g；（2）刺激骨髓細胞分裂，可以預先24 h采取腹腔注射淀粉湯，剪掉一小塊皮膚，甚至人為制造炎癥和刺激造血，以促進骨髓細胞分裂增殖[2]；（3）分裂中期細胞阻滯，通常通過腹腔注射秋水仙素以引起骨髓細胞和睪丸細胞周期停滯在分裂中期，關鍵在于秋水仙素的注射劑量和處理時間。通常采用4 μg/g BW的劑量提前處理3～4 h來阻斷骨髓細胞分裂，而對于睪丸細胞，有研究證實提前6 h注射6 μg/g BW的秋水仙素效果較好。

6.2 低滲處理

低滲的目的是通過吸水膨脹，增大細胞體積，充分分散染色體，防止染色體纏繞。低滲處理的適當與否決定了染色體的分散程度，低滲不充分，染色體分散不徹底，低滲過度，容易造成細胞破裂。低滲一般使用0.4%KCl溶液，在37 ℃水浴鍋中低滲處理30 min，溶液需要提前預熱，增強處理效果。同時低滲溶液的用量盡可能多，以保證低滲效果。筆者的實驗經驗是一般細胞懸液體積控制在1 mL左右，低滲溶液可以添加8 mL。

6.3 固定

固定的目的是穩(wěn)定染色體結構。通常需要進行固定，首先是預固定，在低滲處理結束后，直接加入1 mL甲醇-冰醋酸固定液，混勻1～2 min，以防止細胞結塊，離心后再用固定液重復固定2～3次，每次10 min，以保持染色體形態(tài)。固定液一定要新鮮配制。由于固定液中的甲醇易揮發(fā)、毒性大，可用乙醇替代，效果一致[3]。

6.4 滴片

通過滴片可以破碎細胞，使染色體分散附著在載玻片上，便于后續(xù)的染色，顯帶等核型分析。因此，滴片也是染色體制備的關鍵環(huán)節(jié)之一。要做好滴片，首先要提前準備好載玻片，載玻片必須清潔干凈，不含油脂雜質，至少提前4 h冷凍，通過低溫促使液滴擴散，使細胞牢固的附著在載玻片上，同時通過凍融促進細胞破裂。其次控制好細胞濃度，由于獲得的骨髓細胞較少，操作環(huán)節(jié)中可能還有部分細胞丟失，滴片時的細胞數量一般不是很多，因此在固定離心后，盡量保留較少的固定液，一般只保留0.5～1 mL，以提高細胞密度。最后滴片時要控制好高度，高度太低細胞分散不夠，染色體容易重疊，高度過高增加操作難度，造成細胞損失，導致染色體過于分散，斷裂，丟失。根據筆者的經驗，0.8～1.0 cm的高度就能夠保證液滴擴散良好，染色體分散均勻。如果細胞數量太少，可以提前在載玻片背面畫圈，滴片時將細胞滴在圈內，能夠增加圈內的細胞數量，便于鏡檢觀察。

7 結語

染色體制備技術是細胞生物學的一項核心基本技術，制備過程步驟多，耗時長，影響因素多，成功率低。因此，除了選擇合適的細胞材料進行中期誘導，還需要控制好每一個操作環(huán)節(jié)，消除干擾因素，才能獲得理想的中期分裂相染色體。

[1]唐慕湘,張興華,陳家強,等.小鼠染色體制備方法初探[J].解剖學研究,2011,33(2):160.

[2]牛新華,鄭白玉.在小鼠骨髓細胞染色體制備實驗中增加中期分裂相的方法[J].生物學通報,1999(1):33.

[3]譚軍,楊泗溥,單玉秀.睪丸染色體制片方法幾點改進與體會[J].癌變 畸變 突變,2003,15(2):120-121.