邵建業(yè)，孫林，趙巍，王斌

（1.青島大學生命科學學院，山東青島 266071；2.青島大學基礎醫(yī)學院，山東青島 266071）

自噬與癌癥、神經退行性疾病、各種人類發(fā)育過程有關，相關的自噬研究在過去十幾年中顯著增加[1]。在真菌中，cAMP信號通路參與多種生物學過程，并且已被證明對免疫抑制的侵襲性曲霉病鼠科動物模型的毒力至關重要。cAMP途徑的主調控因子PKA是真核生物中重要的應激反應調節(jié)劑[2]。PKA為異四聚體，是細胞中調節(jié)生長、代謝、增殖的一個重要的信號分子。當cAMP與調節(jié)亞基結合時，發(fā)生構象變化，釋放催化亞基使其自磷酸化并磷酸化下游靶標。當cAMP結合調節(jié)亞基時，會發(fā)生構象變化，其釋放催化亞基自動磷酸化下游目標[3]。PKA信號通路參與了煙曲霉的生長、孢子的形成過程以及影響煙曲霉的毒力，但其對曲霉菌自噬的影響并不明確。

為研究煙曲霉中PKA與其自噬水平的關系，本實驗采用ΔPkaR突變株和WT株，從孢子的存活率、菌絲營養(yǎng)獲取能力、自噬小體的形態(tài)以及自噬相關的基因表達來反應自噬水平，驗證煙曲霉中的自噬是否受PKA通路的調控，為絲狀真菌中的自噬機制提供新的實驗證據[4]，爭取為預防和治療IA提供一個新的靶點。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

煙曲霉（A.fumigatus）野生菌株（簡稱WT）為美國辛辛納提大學病理和實驗醫(yī)學系Judith C Rhodes教授惠贈，PKA調節(jié)亞基突變株（簡稱ΔPkaR）為本實驗室構建，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育。

1.1.2 培養(yǎng)基

AMM液體培養(yǎng)基、AMM固體培養(yǎng)基、YG液體培養(yǎng)基、YG固體培養(yǎng)基、WA培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 營養(yǎng)缺乏時營養(yǎng)吸收能力的檢測

（1）收取AMM培養(yǎng)基上新鮮的孢子；（2）在4℃、4500r/min條件下離心5min，再用無菌蒸餾水清洗兩次，然后重懸于無菌蒸餾水中；（3）顯微計數，稀釋孢子濃度至1×104個/mL，用移液槍吸取孢子懸浮液，用三角玻璃棒均勻涂布于平板上；（4）在37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育24h，然后使用吸管從平板上取單個菌，移到WA平板的中心排布；（5）在37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育4～5天，孵育24h時，開始測量菌落直徑。

1.2.2 Real-time PCR法檢測自噬相關基因的表達

將WT和ΔPkaR菌株的孢子以1.0×107個/mL濃度分別接種于AMM液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)8.5～9h，然后轉移到1.5mLEP管中離心棄上清，將菌體沉淀用滅菌過的濾紙進行進一步干燥處理。采用液氮研磨法破碎菌體后加Trizol提取總RNA，用反轉錄試劑盒轉錄為cDNA，再以cDNA為模板擴增。Real-time PCR反應體系見表1，反應參數：95℃預變性1min；95℃、15s，56℃、15s，72℃、1min，共40個循環(huán)。擴增反應完成后，應用軟件設定閾值，使其處于擴增的指數增長期，并確定閾值循環(huán)數（Ct），計算Δ Ct（實驗組內參照、目的基因的Ct值減去對照組內參照、目的基因的Ct值）和ΔΔ Ct（目的基因的Δ Ct值減去內參照基因的Δ Ct值），根據2-ΔΔCt計算實驗組目的基因相對于對照組目的基因變化的倍數。擴增引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表2，內參為GAPDH。

表1 Real-time PCR反應體系

表2 實驗所用引物

2 結果與分析

2.1 PkaR敲除對煙曲霉菌絲的覓食能力的影響

將已培養(yǎng)24h的WT和ΔPkaR菌的單菌落轉移到YG和缺乏營養(yǎng)的WA培養(yǎng)基上，24h測一次菌落直徑，結果如圖1所示。由圖1可知，WT 72h長滿了整個平板，菌落直徑6.5cm，ΔPkaR 120h達到最大直徑4.2cm，表明PkaR的敲除影響了頂端菌絲的延伸，抑制了菌絲的伸長。轉移到WA培養(yǎng)基上的菌株，WT菌絲生長速度減緩，168 h達到最大直徑，但ΔPkaR72 h時停止生長，菌落直徑1.5cm，WA培養(yǎng)基上缺乏營養(yǎng)，饑餓可以誘導自噬，表明自噬對煙曲霉菌絲的延伸沒有影響。

圖1 YG和WA培養(yǎng)基上菌落的變化

2.2 PkaR敲除對煙曲霉Atg1的mRNA水平的影響

對AMM培養(yǎng)基中培養(yǎng)了一段時間后的WT和ΔPkaR菌株提取RNA，進行Real-time PCR定量分析，結果如圖2所示。由圖2可知，與WT組相比，ΔPkaR組Atg1的mRNA水平顯著上升，差別具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。以上結果表明，PkaR敲除后能增加Atg1的mRNA水平，PkaR可能抑制細胞自噬。

圖2 PkaR敲除對煙曲霉Atg1的mRNA水平的影響

2.3 PkaR敲除對煙曲霉Atg8的mRNA水平的影響

對AMM培養(yǎng)基中培養(yǎng)了一段時間后的WT和ΔPkaR菌株提取RNA，進行Real-time PCR定量分析，結果如圖3所示。由圖3可知，與WT組相比，ΔPkaR組Atg8的mRNA水平顯著上升，差別具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。以上結果表明，PkaR敲除后能增加Atg8的mRNA水平，PkaR可能抑制細胞自噬。

圖3 PkaR敲除對煙曲霉煙曲霉Atg1的mRNA水平的影響。

2.4 PkaR敲除對煙曲霉Atg11的mRNA水平的影響

對AMM培養(yǎng)基中培養(yǎng)了一段時間后的WT和ΔPkaR菌株提取RNA，進行Real-time PCR定量分析，結果如圖4所示。由圖4可知，與WT組相比，ΔPkaR組Atg11的mRNA水平顯著上升，差別具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。以上結果表明，PkaR敲除后能增加Atg11的mRNA水平，PkaR可能抑制細胞自噬。

圖4 PkaR敲除對煙曲霉Atg11的mRNA水平的影響

3 結論

（1）PKA調節(jié)亞基促進煙曲霉的自噬的發(fā)生。（2）PKA調節(jié)亞基可能是通過促進Afatg1、Afatg8和Afatg11的表達來提高煙曲霉的自噬水平。

煙曲霉是免疫缺陷宿主的重要致病性真菌病原體，普遍存在于人們周邊，其孢子極小，漂浮于空氣中，可隨呼吸進入肺中[5]。在水分和足夠的營養(yǎng)物質的存在下，如在哺乳動物肺中，休眠的分生孢子破壞代謝和細胞周期的休眠。經過一段時間的核分裂和各向同性生長（膨脹）后，每個分生孢子建立一個極軸，然后發(fā)展成侵入性菌絲，引起侵染性曲霉病[6]。因此，分生孢子萌發(fā)代表了煙曲霉生命周期中的關鍵過程，并且是吸入后，成為侵入性曲霉菌病發(fā)展中的第一個關鍵步驟。免疫功能健全的人，吸入的孢子會被自身免疫清除；而對免疫受損的個體，吸入的孢子則會引起侵染性曲霉病或過敏反應，危及生命[7]。

煙曲霉基因測序完成后，發(fā)現了大量未知功能的基因堿基序列。RNA干擾、基因敲除等基因功能的研究技術和方法，開始被應用于研究未知功能的基因，來試圖找到煙曲霉的關鍵毒力因子[8]。而自噬是一種通常由饑餓應激觸發(fā)的細胞存活反應，在真菌中，自噬的報道相對較少，但真菌的滲透性，菌絲體的生長發(fā)育和它們能侵入不均勻、營養(yǎng)缺乏的物質的非凡能力，有力地表明自噬可能是真菌生活方式的基礎。

本實驗證明，自噬的發(fā)生對煙曲霉分生孢子的存活率以及菌絲的生長有影響，但對其侵染性的作用未知。自噬通常被認為是促生存的過程，它對于細胞在細胞外環(huán)境中應對營養(yǎng)不足至關重要[9]。因此，當營養(yǎng)供應不足以滿足細胞能量需求，或者當細胞暴露于不同形式的應激時，自噬就會上調。在這些條件下，一些研究表明自噬作用可以保護細胞免受各種真核生物的死亡。然而，自噬也被證明是細胞死亡的一個促成因素，是真核生物中存在一種非凋亡性程序性細胞死亡途徑，這種途徑取決于自噬基因[10]。在大多數情況下，這些自噬的雙重作用可能取決于當時的細胞外環(huán)境條件。已經了解TOR激酶在感染相關自噬的啟動中和PKA信號潛在的相互作用，對其附著胞形態(tài)發(fā)生是必需的，因此，在煙曲霉中了解TOR激酶和PKA信號的潛在聯系，以及煙曲霉自噬的基因組分析，對于了解煙曲霉感染至關重要[11]。如果能驗證自噬在煙曲霉侵染過程中的重要性，控制煙曲霉自噬的發(fā)生，可能成為開發(fā)新型抗真菌藥物提供新的靶標。

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