劉文武 馬賓 錢鈞 毛建華 侯發(fā)琴

(馬鞍山市中心醫(yī)院心內科，安徽 馬鞍山243000)

缺血性心血管疾病是嚴重危害人類健康的常見病，而縮短組織缺血時間,盡早恢復血流,是防治缺血損傷最有效的措施，血管內溶栓治療、經皮穿刺冠狀動脈腔內成形術、冠脈搭橋術等再灌注療法通過恢復缺血組織的供血有效地挽救缺血組織，是治療心肌缺血和梗死的最主要措施。但是再灌注療法受缺血組織血管再通時間的限制并存在再灌注損傷等問題。因此，隨著新的再灌注技術的長足進展，防治再灌注損傷成了冠心病治療亟待解決的關鍵問題之一。自1986年Murry首次提出缺血預處理(ischemic preconditioning，IPC)概念以來，30年的試驗研究證實，IPC是目前認為最強及最有效的內源性保護機制,能有效地減少心肌缺血再灌注損傷，應用藥物預處理防治心肌缺血再灌注損傷已成為研究熱點[1]。1991年，Inoue 等通過膜片鉗技術發(fā)現線粒體ATP敏感性鉀通道(mitochondrial ATP-sensitive potassium channel，mitoKATPC), 隨其特異性開放劑與抑制劑的發(fā)現及研究的不斷深入,其在心血管領域的心肌保護，尤其在預適應心肌保護中的作用日益突出[2]。本研究通過靜脈注射特異性mitoKATP通道開放劑吡那地爾，觀察其對兔心肌缺血再灌注損傷的保護作用,探討mitoKATP通道在缺血再灌注損傷中的作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料及分組 清潔級健康家兔50只，體重(3±0.5)kg，由蚌埠醫(yī)學院動物實驗中心提供, 許可證：SCXK皖：2016-0047。隨機分為假手術組(SO組)：采用左冠狀動脈下穿線不結扎，持續(xù)160min；缺血再灌注組(I/R組)：采用左冠狀動脈下穿線，拉緊絲線引起心肌缺血，放松絲線給予再灌注的方法建立心肌缺血再灌注損傷動物模型，缺血40min，再灌注120min；硝酸甘油組(NG組)：缺血前1h靜滴硝酸甘油100ug/kg，再行缺血再灌注；吡那地爾組(PN組)：缺血前30min靜滴吡那地爾250μg/kg，再行缺血再灌注；硝酸甘油聯合吡那地爾組(NG+PN組)：缺血前1h靜滴硝酸甘油100μg/kg，30 min時靜滴吡那地爾250μg/kg，再行缺血再灌注，每組10只。吡那地爾購自sigma公司，血清SOD/MDA/NO試劑盒購自南京建成生物研究所。

1.2 動物模型的建立 家兔經耳緣靜脈緩慢推注20%烏拉5ml/kg，背部及四肢固定于兔板上，分離氣管,切開后插管，連接小動物微型呼吸機行機械通氣，頻率設置為50次/min，潮氣量為10ml/kg，給予呼吸末正壓通氣，吸氣與呼氣之比為1：2，壓力0．75～1．5kPa。四肢及胸部連接電極，監(jiān)測胸導聯及肢體導聯心電圖。整個實驗過程通過MedLab生物信號采集處理系統(tǒng)監(jiān)測、記錄。按文獻方法：于胸骨左側0．5cm處用組織剪從第3～5肋骨縱行剪開2.5cm切口，鈍性分開肌層，4號線縫扎第四肋骨兩端后將其剪斷，打開胸腔并用小動物開胸器將其撐開暴露心臟，剪開心包，以左冠狀動脈主干為標志，于左心耳根部下2mm處進針，以0號無損傷絲線穿過心肌淺層在肺動脈圓錐旁出針，將絲線兩端穿過自制的1根長2cm、直徑3mm的聚乙烯小管，輕輕拉緊絲線兩端，用小止血鉗夾持細管，以結扎后心電圖ST段呈弓背樣抬高明顯，結扎線遠端心肌呈現紫紺為結扎成功標準。結扎40min后取出硅膠管，胸導聯ST段下降超過1/2為再灌注成功的標準。

1.3 觀察指標及檢測方法 ①血清SOD/MDA/NO/CK指標及測定：分別于心肌再灌注0、30、60、120min經兔股靜脈取血2ml，待室溫靜置2h后3500r/min離心10min，分離血清，嚴格按照試劑盒說明要求測定[用硫代巴比妥酸法檢測丙二醛(MDA)、羥胺法檢測超氧化物歧化酶(SOD)，硝酸還原酶法檢測一氧化氮(NO)、肌酸激酶(CK)]。②經右頸總動脈切開置22號導管至左心室，連接40kPa壓力換能器監(jiān)測血流動力學指標(LVSP、LVEDP)。整個實驗過程通過MedLab生物信號采集處理系統(tǒng)監(jiān)測、記錄。③心肌缺血壞死范圍測定：實驗結束后于原結扎點冠脈重新結扎，剪斷第三肋骨鈍性分離周圍組織暴露主動脈，并用直鉗夾閉主動脈，從左心室注入1%伊文思藍2ml，心臟變成藍色后迅速取出心臟，剔除心房、結締組織，放入PBS溶液(0.02 mmol/L，pH=7.4)中漂洗數次，洗去血液，干凈紗布吸去水分，置于-20℃冰箱30min，取出待其稍解凍后，沿垂直心臟縱軸方向從心尖到結扎線下方將其切成1.5～2.0mm厚的薄片，共約7或8片置于1%氯化四唑(TTC)磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)，在37OC下染色15min，未缺血區(qū)域為藍色，危險區(qū)及梗死區(qū)為磚紅色、灰白色或土黃色，呈不規(guī)則、島嶼狀分布。切片用10%甲醛溶液固定后照相(Nikon3100), 使用計算機輔助軟件(Image-Pro Plus, Media Cybernetics)處理缺血危險區(qū)占左心室的比例。

2 結果

2.1 硝酸甘油及吡那地爾對SOD/MDA/NO的影響

2.1.1 SOD 在各時間段SO、NG、PN組和NG+PN組均高于I/R(P<0.01或P<0.05)，NG+PN組又高于NG、PN組(P<0.01)，見表1。

2.1.2 MDA 在各時間段SO、NG、PN和NG+PN組均低于I/R組(P<0.01或P<0.05),NG+PN組又低于NG、PN組(P<0.01)，見表2。

表1 各組在各時間段SOD比較Table 1 The SOD in each group at each time point

注：與I/R組比較，①P<0.01；與SO組比較，②P<0.01；與PN 、NG組比較，③P<0.01

表2 各組在各時間段MDA比較Table 2 The MDA in each group at each time point

注：與I/R組比較，①P<0.01；與SO組比較，②P<0.01；與PN 、NG組比較，③P<0.01

2.1.3 NO 在各時間段SO、NG、PN和NG+PN組均高于I/R組(P<0．01或P<0.05)，NG+PN組又高于NG、PN組(P<0.01)，見表3。

表 3 各組在各時間段NO比較Table 3 The NO in each group at each time point

注：與I/R組比較，①P<0.01；與SO組比較，②P<0.01；與PN 、NG組比較，③P<0.01

2.2 各組心室內壓比較

2.2.1 LVSP 在各時間點I/R、PN、NG、PN+NG組較SO組明顯下降(P<0.01)；在T30、T60時，I/R組較PN+NG組下降(P<0.05)；在T90時，I/R組較NG、PN+NG組下降(P<0.05或P<0.01)；在T150時，I/R組較NG、NG+PN組下降(P<0.01)，亦較PN組下降(P<0.05)，見表4。

表 4 各組在各時間段LVSP比較Table 4 The LVSP in each group at each time point

注：與I/R組比較，①P<0.05；②P<0.01；與SO組比較，③P<0.01；與PN組比較，④P<0.01；與NG組比較，<0.01

2.2.2 LVEDP 在T30時各組沒有顯著差異(P>0.05)；在T60、T120、T150時I/R組均較SO、NG、NG+PN顯著提高(P<0.01)；在T60時I/R組較PN組下降(P<0.05)，見表5。

2.3 各組心肌酶比較 在各時間段， I/R組較SO、PN、NG+PN組顯著提高(P<0.01)，其中在T0時間段，I/R組較NG組提高(P<0.05)；在其余時間段，NG、PN組較NG+PN組顯著提高(P<0.01)，其中在T0、T60時間段，NG、PN組較NG+PN組顯著提高(P<0.05)，見表6。

表5 各組在各時間段LVEDP比較Table 5 The SOD in each group at each time point

注：與I/R組比較，①P<0.05；②P<0.01；與SO組比較，③P<0.05,④P<0.01

表6 各組在各時間段CK比較Table 6 The CK in each group at each time point

注：與I/R組比較，①P<0.05；與SO組比較，②P<0.05；與PN 、NG組比較，③P<0.05，④P<0.01

2.4 各組心肌梗死面積比較 NG、PN、NG+PN組較I/R組梗死面積明顯縮小(P<0.01)，其中NG+PN組梗死面積又較NG、PN組縮小(P<0.01或P<0.05)，見表7。

3 討論

心肌持續(xù)性缺血導致組織損傷和細胞壞死，及早恢復再灌注是減輕缺血損傷的最主要途徑，但再灌注后一系列的形態(tài)、功能、代謝方面的病理生理學變化，將導致缺血損傷反而進一步增加。損傷的最根本機制是氧自由基的大量產生和細胞內Ca2+超載以及隨之而來的微血管功能障礙[3]。

3.1 硝酸甘油的心肌保護作用 NO是一種潛在的擴血管劑和抗氧化劑，硝酸甘油作為NO供體，在體內產生NO。本研究結果表明，①NG組的血清NO含量在再灌注即刻均較I/R組顯著提高(P<0.01)，但與吡那地爾組比較，差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)；同時顯著提高再灌注各時間段血清SOD(P<0.01)和降低血清MDA含量(P<0.01)，說明給予外源性NO供體可提高體內的NO含量，減少缺血再灌注心肌氧自由基的大量生成， 從而減輕氧自由基引起的血管內皮和心肌的損傷，抑制血小板趨化聚集黏附于血管內皮，直接作用于NADPH氧化酶表面膜元件而抑制中性粒細胞(PMN)超氧因子的產生，并阻止其與血管內皮細胞的黏附作用[4]。②GN組再灌注期間各時間段心功能指標LVSP明顯高于I/R組(P<0.01)，LVEDP明顯低于I/R組(P<0.01)，說明相比于I/R組，GN組心功能在再灌注期間得到較好地恢復，可能源于血管平滑肌細胞內鈣離子濃度的減少，繼而引起鈣依賴性鉀通道的激話和cGMP依賴性PKGI的激活，以及cGMP依賴性電壓門控鈣離子通道的抑制引起血管擴張[5]。③硝酸甘油能明顯減少再灌注期間血清心肌酶LDH、CK的釋放量，縮小心肌梗死面積(與對照組比較，P<0.01)?？赡芘c下列機制有關：a.血管內皮細胞釋放的NO是一種很強的舒血管物質，可擴張冠狀動脈，改善微循環(huán)[6]。b.NO抑制內皮細胞TGF-β1/Smad信號通路的反式激活。已知TGF-β1表達上調可以促進心肌梗死后炎癥反應，通過抑制內皮細胞TGF-β1/Smad信號通路可以降低由于缺血再灌注損傷所致的心肌炎癥、心肌纖維化，減輕心肌細胞壞死凋亡以及由此而導致的心肌重塑。C.絲裂原活化蛋白激酶、p38MAPK【7-8】、c-Jun NH2-terminal kinase[9]在缺血再灌注時活性增強，并引發(fā)炎性細胞因子表達轉錄活性，NO可能也作用于作為TGF-β1/Smad信號通路組成部分的絲裂原活化蛋白激酶，抑制炎性細胞的表達，進而提高心臟功能，限制心肌梗死后的心肌重塑。

Table7Thesizeofmyocardialinfarctofeachgroupwastheproportionoftheleftventricle

組別n危險區(qū)/左心室I/R組1054 33±7 1SO組100．00±0．00NG組1040 83±7 8①PN組1038 67±8 0①NG+PN組1027 7±8 3①②③

注：與I/R組比較，①P<0.01； 與PN組比較，②P<0.05；與NG組比較，③P<0.05

3.2 吡那地爾的心肌保護作用 ATP敏感性線粒體鉀通道在預防缺血再灌注損傷中起著重要的作用[10]。本實驗選擇ATP敏感性線粒體鉀通道開放劑——吡那地爾預處理兔缺血再灌注，觀察其對心肌保護作用及機制。結果表明，①吡那地爾顯著增加血清NO(P<0.01)，但沒有硝酸甘油組明顯?？赡苡捎谛募∪毖A適應中,機體刺激心臟釋放內源性心肌保護物質，如腺苷、兒茶酚胺、緩激肽, 激活NO-cGMP蛋白激酶G通路[11],激活一氧化氮合酶產生NO。②吡那地爾明顯降低循環(huán)中的MDA，顯著提高SOD[12]。說明吡那地爾可能使KATP通道活化，逆轉鈣超載和穩(wěn)定細胞膜，保護線粒體的完整及功能，減少氧自由基的發(fā)生，減輕組織的過氧化物損害，以及抑制中性粒細胞的聚集，促發(fā)NO的生成，保護血管內皮細胞及功能，并使心肌組織對氧和能量物質的利用效率提高。③吡那地爾可以降低缺血心肌的CK、LDH的釋放量，縮小心肌梗死面積(P<0.01)。可能與以下機制有關：a.使K+通道開放數量增加，K+外流增加，使細胞復極化速率加快，縮短了心肌動作電位時程[13]，且平臺期縮短更顯著，從而抑制了電壓依賴性鈣通道的Ca2+內流，加速了Na+-Ca2+交換而增加細胞內Ca2+排出，減輕鈣超載對心肌的損傷作用[14、15]。b.心肌細胞內Ca2+濃度降低，又使其在缺血期收縮活動減弱，以及減少心肌攣縮的發(fā)生，耗能減少，有利于保護心肌。④吡那地爾還具有改善血液循環(huán)作用，明顯提高再灌注期間LVSP,并發(fā)現有輕度抑制心率及心臟舒張功能[16]，可能與K+通道開放, 使冠狀動脈平滑肌細胞內K+外流增加, 細胞膜電位加大, 發(fā)生超極化,細胞內游離的Ca2+濃度下降，并降低血管平滑肌收縮成分對Ca2+的敏感性，使血管舒張, 冠脈流量增加；還可直接通過影響細胞內磷酸化酶系統(tǒng)而產生舒血管作用，從而有利于代謝產物的清除, 保證心肌組織灌注，促進心功能的恢復及抗心律失常作用[17]。

3.3 吡那地爾聯合硝酸甘油的心肌保護作用 實驗證實，硝酸甘油、吡那地爾單獨預處理缺血再灌注心肌時均有明顯的心肌保護作用，減小心肌梗死面積。顯示NO和mitoKATPC是缺血預適應發(fā)生機制中的兩個重要環(huán)節(jié)[18]，依據缺血預適應的作用機制，設想了在缺血預適應發(fā)生機制中不同環(huán)節(jié)上聯合藥物預處理對缺血再灌注心肌的保護作用是否會更強[19]。結果表明，①NG+PN組在再灌注各時間段均能顯著提高血清SOD，降低血清MDA。說明聯合藥物預處理具有更強地減少缺血再灌注心肌過氧化物物質的產生，減輕過氧化物對血管內皮及心肌組織的損害。②實驗結果也證實，硝酸甘油和吡那地爾聯合應用，通過不同的作用環(huán)節(jié)減少心肌組織的CK和LDH釋放量，縮小心肌梗死面積，促進再灌注期間心臟LVSP、+dp/dmax功能的恢復。其機制推斷與下列因素有關[20]：a.NO直接作用于KATP內部具有NO敏感性的氨基酸結合位點,開放KATP通道蛋白,或通過磷酸化蛋白激酶G升高cGMP水平,激活相關蛋白激酶,使心肌細胞的KATP開放增加 。b.同時吡那地爾作為mitoKATPC開放劑在心肌缺血預適應中啟動了機體內源性心肌保護物質，如腺苷、兒茶酚胺、緩激肽, 激活NO-cGMP蛋白激酶G通路,進而激活一氧化氮合酶產生NO，增強相互之間的療效。

4 結論

本試驗設計了單一藥物和聯合藥物預處理組來作用于缺血預適應的不同環(huán)節(jié)，觀察其對缺血再灌注心肌的保護作用，發(fā)現聯合用藥可以發(fā)揮更強的心臟保護作用。

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