麥麥提艾力·阿不力克木 王騰飛 陶 穎 王曉帥 徐磊磊 宋興華

(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院骨科中心，烏魯木齊 830054)

引言

中國是結核病高負擔國家，2015年全國發(fā)病率僅次于印度和印度尼西亞，發(fā)病絕對數量占全球結核病人數量的9.6%[1]。在所有結核患者中，10%～15%是肺外結核，而肺外結核中居首位的是骨與關節(jié)結核[2-3]。近年來，藥物耐受以及伴有HIV 感染的結核病發(fā)病率急劇增加，加劇結核控制的困難[4]。目前，臨床上多采用手術治療與全身化療的綜合性治療，而長期全身化療引起的副反應和手術治療后形成的骨缺損填補是外科醫(yī)生治療骨關節(jié)結核面臨的難題。為了在治療中既可以修復骨結核病灶清除后的骨缺損，同時也在局部能夠保持有效的藥物濃度，有效地預防結核復發(fā)，本研究擬構建新型骨組織復合體rADSCs+利福噴丁聚乳酸緩釋微球+HA/β-TCP。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

DMEM培養(yǎng)基(HyClone)，10%胎牛血清(HyClone)，鏈霉素-青霉素雙抗溶液(Gibco),I型膠原酶(Worthington)，磷酸鹽緩沖液PBS(HyClone)，3%戊巴比妥鈉(Merck)，25%胰蛋白酶溶液(HyClone)，維生素C(Gibco)，β-甘油磷酸納(美國，sigma)，地塞米松(美國，sigma)，茜素紅染液(美國，sigma)，利福噴丁標準品(中國藥品生物制品檢定所，批號為60748-201007, 含量為99.3%)，聚乳酸(聚乳酸，試劑級為3萬，山東醫(yī)療器件有限公司)，明膠(美國，sigma)，二氯甲烷、甲醇等試劑(分析純，市售)，羥基磷灰石/β-磷酸三鈣(Bi-Ostetic)。

1.2 實驗儀器

超凈工作臺(Thermoscientific)，CO2培養(yǎng)箱(Thermoscientific)，水浴箱(上海精密設備)，752紫外可見分光光度計(日本島津)，ME204E電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，顯微鏡(Leica)，電鏡(上海菁華科技儀器有限公司)，JJ-1 A-40 W數顯增力電動攪拌器(金壇市天竟實驗儀器廠)，制冰機(上海精密科學儀器有限公司)，低速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)，Savant modulyo冷凍干燥機(美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1rADSCs的分離培養(yǎng)及成骨誘導鑒定

取一只麻醉滿意的兔子，嚴格無菌取腹股溝脂肪組織，將其放入裝有D-hanks緩釋液的培養(yǎng)皿中。于超凈臺在DMEM生長液中將脂肪組織剪碎成糊狀，置于20 mL 0.075% I型膠原酶溶液中，37℃水浴箱中消化30 min后，加入3倍體積的DMEM終止消化，以2000轉/min離心10 min后，棄上清液及表層漂浮脂肪碎屑，加入3倍體積的DMEM生長液，充分吹打混勻，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，取第3代rADSCs，滴加成骨誘導劑：DMEM生長液+維生素C(50 μmol/L)+β-甘油磷酸納(10 mmol/L)+地塞米松(1×10-7mol/L)，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，成骨誘導14 d后茜紅染色，觀察。

1.3.2利福噴丁聚乳酸緩釋微球對rADSCs增殖及成骨活性的影響

按照復乳-溶媒揮發(fā)法[5-6]制備利福噴丁聚乳酸緩釋微球，即稱取聚乳酸0.1 g完全溶解于5 mL二氯甲烷，加入0.1 g利福噴丁，于4℃冰塊超聲細胞粉碎儀進行超聲乳化(超聲1 s，間隙2 s，功率為200 W)1.5 min，高速攪拌下緩慢注入到25 mL的0.5%明膠水溶液中，形成O/W乳液，加入75 mL蒸餾水進行稀釋，再溫和持續(xù)攪拌6 h，將獲得的懸浮液通過0.88 μm孔徑的水系濾膜抽濾，收集并用蒸餾水洗滌，離心(2000轉/min,15 min)數次后冷凍干燥24 h，并計算微球載藥率及包封率，顯微鏡及掃描電鏡下觀察形態(tài)大小及表面形態(tài)結構。取第3代rADSCs(濃度為3×106個/mL)400 μL與微球3 mg混合均勻后接種于培養(yǎng)皿中，設置2個復皿。設立對照組及未加入利福噴丁聚乳酸緩釋微球，均滴加成骨誘導劑，成骨誘導14 d后茜紅染色，觀察。

1.3.3利福噴丁聚乳酸緩釋微球+rADSCs+HA/β-TCP的復合

對用60Co-γ照射消毒并在成骨誘導劑中浸泡24 h的HA/β-TCP，在用無菌濾紙吸凈培養(yǎng)基后，將第3代rADSCs懸液400 μL緩慢滴加，在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后，將其移至新的培養(yǎng)皿中，加入成骨誘導劑，往第一個培養(yǎng)皿中滴加2.5 g/L胰蛋白酶消化，計算流失細胞數。取第3代rADSCs懸液400 μL與微球3 mg混合后，緩慢滴加到HA/β-TCP支架上，在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)4 h后，將其移至新的培養(yǎng)皿中，加入成骨誘導劑，往第一個培養(yǎng)皿中滴加2.5 g/L胰蛋白酶消化，計算流失細胞數。將上述2個復合體置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，在震蕩培養(yǎng)后，將2個復合體移至新的培養(yǎng)皿中，加入成骨誘導劑后繼續(xù)在5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。舊的培養(yǎng)皿中滴加2.5 g/L胰蛋白酶消化，計算未黏附細胞數。將上述2個復合體在成骨誘導中培養(yǎng)14 d后，沿皿壁吸凈培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛固定過夜，95%、75%、45%乙醇逐級脫水、噴金后，掃面電鏡觀察rADSCs在HA/β-TCP支架的黏附及生長情況，以及微球和rADSCs在HA/β-TCP支架上的黏附情況。

1.3.4利福噴丁聚乳酸緩釋微球+rADSCs+HA/β-TCP三維復合體的體外釋藥性

稱取利福噴丁標準品10 mg，滴加成骨誘導劑基定容至25 mL容量瓶刻度，從中分別精取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL液體，滴加至25 mL容量瓶中，用成骨誘導劑基定容至刻度，用紫外分光光度法在475 nm下檢測吸光度，畫出利福噴丁濃度(c)對吸光度(A)的線性回歸曲線為標準曲線。將上述三維復合體置于培養(yǎng)皿中，隔日換液并收集培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基離心后取上清液，在475 nm下檢測吸光度(A)，并代入標準曲線中算出利福噴丁濃度。以時間為橫坐標，累計釋放量為縱坐標，繪制藥物釋放曲線。

2 結果

2.1 rADSCs及成骨誘導的顯微鏡觀察

第3代rADSCs呈梭形，鏡下可見排列有一定的方向性，呈漩渦狀排列分布(見圖1)。rADSCs體外成骨誘導，茜素紅染色后，經顯微鏡觀察發(fā)現，細胞外基質被染成深紅色(見圖2)。

2.2 利福噴丁聚乳酸緩釋微球+rADSCs二維復合體

大體觀察，微球外觀呈橘紅色粉末狀，無明顯的聚集(見圖3)。掃描電鏡下呈圓球狀，無粘連成團，表面光滑(見圖4)。微球平均直徑(21.82±5.32)μm，76.4%的微球粒徑分布在18～28 μm范圍(見圖5)，微球載藥率(27.57±4.72)%，包封率(82.31±1.28)%。微球與第3代rADSCs經成骨誘導14 d，茜素紅染色后，顯微鏡下發(fā)現深紅染色的許多結節(jié)，微球表面塌陷，但保持圓形輪廓(見圖6)。

圖1 第3代兔脂肪干細胞 (10×)Fig.1 The third generation rADSCs (10×)

圖2 成骨誘導14 d茜素紅染色 (5×) Fig.2 The alizarin red dye after osteogenic induction (5×)

圖3 微球大體觀 Fig.3 The microspheres

圖4 微球掃描電鏡(600×)Fig.4 The microspheres′s SEM view (600×)

圖5 微球粒徑分布 Fig.5 The size distribution of microspheres

圖6 微球-rADSCs二維復合體(5×)Fig.6 The two-Dimensional Complex(5×)

2.3 利福噴丁聚乳酸緩釋微球+rADSCs+HA/β-TCP的復合

rADSCs+HA/β-TCP復合體細胞黏附率(94.24±1.25)%，微球+rADSCs+HA/β-TCP復合體細胞黏附率(92.02±0.74)%，兩組數據比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。在掃描電鏡下，HA/β-TCP表面呈不規(guī)則顆粒狀，各孔間相通，孔隙大小不等。

rADSCs+HA/β-TCP復合體培養(yǎng)14 d后，可見HA/β-TCP表面被rADSCs層狀膜形分布(見圖7)。微球+rADSCs-HA/β-TCP復合體培養(yǎng)14 d后，HA/β-TCP表面見rADSCs相互融合呈膜狀，并將微球牢固地固定在HA/β-TCP上，釋微球表面塌陷，但保持圓形輪廓(見圖8)。兩組復合體中，rADSCs形態(tài)無明顯差異。

圖7 rADSCs+HA/β-TCP復合體(掃描電鏡 200×)Fig.7 The two-Dimensional Complex(SEM 200×)

圖8 微球+rADSCs+HA/β-TCP復合體(掃描電鏡 200×)Fig.8 The three-Dimensional Complex(SEM 200×)

2.4 利福噴丁聚乳酸緩釋微球+rADSCs+HA/β-TCP三維復合體的體外釋藥性

根據紫外線分光光度計的吸光值(A)結果，得出利福噴丁標準品在含成骨誘導劑的DMEM培養(yǎng)基中的標準曲線：A=12.513c-0.011 7(R2=0.999 6)(見圖9)。微球+rADSCs+HA/β-TCP三維復合體第6 d釋放量最高，達0.127 8±0.000 2 mg，第46 d累計釋放量達89.733% (見圖10、11)。

圖9 標準曲線 Fig.9 The standard curve

圖10 藥物釋放濃度 Fig.10 The drug release concentration

圖11 藥物累計釋放百分率Fig.11 The cumulative release rate of drug

3 討論

rADSCs是脂肪組織中具有干細胞特性的細胞群，經過一定的定向培養(yǎng)后，可以分化為成骨細胞、軟骨細胞、肌細胞、內皮細胞和神經前體細胞。Arrigoin等將rADSCs接種于HA支架上，修復脛骨缺損，8周后發(fā)現rADSCs+HA復合體的骨愈合情況明顯好于單純HA的情況[7]。

支架材料在體外構建骨組織工程復合體中具有重要的意義，本實驗中所用的HA/β-TCP 是由60%的 HA和40%β-TCP組成的復合材料，是一種新型的植骨材料，也是目前廣泛應用于臨床的人工骨粒，具有很好的生物相容性、可降解性及骨傳導性，能夠與骨直接形成鍵性結合，形成骨組織，是骨組織工程中比較理想的支架材料。李海建等采用HA/β-TCP復合體材料和家兔同種異體骨進行rADSCs培養(yǎng)，結果發(fā)現rADSCs在兩種材料上附著良好、生長良好、增殖明顯并保持均勻分布，HA/β-TCP復合體材料的生物相容性不弱于同種異體骨的生物相容性，可在骨組織工程中充當細胞載體[8]。

利福噴丁是一種新型半合成的利福霉類抗生素，其抗結核桿菌作用比利福平強2～10倍，最低抑菌濃度(MIC)為0.12～0.39 mg/L，具有高效、低毒、長效的優(yōu)點，是安全有效的抗結核藥物[9-10]。通過復乳-溶媒揮發(fā)法[5-6]制備具有緩慢釋藥的微球，其平均直徑、載藥率及包封率與文獻報道的相仿[11]。本實驗將rADSCs與微球二維復合后成骨誘導，茜素紅染色證明該復合物可向骨分化，成骨誘導14 d后顯微鏡發(fā)現微球表面塌陷，但保持圓形輪廓，可能是微球降解、釋放的結果。rADSCs+微球+HA/β-TCP三維復合后，經檢測復合體中細胞黏附率較高，微球及rADSCs均未見脫落現象，提示rADSCs與微球及支架均有較好的相容性。此外，復合體中微球向外周釋放良好，未見細胞干擾微球釋放的現象。

體外釋藥結果提示，三維復合物初期有“突釋”現象，隨后藥物緩慢釋放，釋放量逐漸減少，符合聚乳酸緩釋材料釋放的一般規(guī)律[12]。釋放周期可達46 d，均高于最低抑菌濃度。實驗結果表明，rADSCs、HA/β-TCP和利福噴丁聚乳酸緩釋微釋球復合，所構建的材料既可以修復骨結核病灶清除后的骨缺損，同時在局部能夠保持有效的藥物濃度，能有效預防結核復發(fā)，為治療骨結核這一臨床難題開辟了嶄新的思路。

4 結論

本實驗用rADSCs、利福噴丁聚乳酸緩釋微球及HA/β-TCP構建新型骨組織工程復合體，可以控制藥物的緩慢釋放，并且在局部維持有效的抗結核藥物的同時，不影響其增殖及成骨活性，為兔脊柱結核的治療提供新的思路，從而引導臨床上治療骨與關節(jié)結核，但其體內抗結核及促進骨愈合作用還需經體內的進一步驗證。

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