張 英，馬瑞霞，杜艷云，史亞男

(1.新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院婦瘤一科，河南 新鄉(xiāng) 453000；2.河南省榮康醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 新鄉(xiāng) 453000；3.中山大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 廣州 510000)

子宮內(nèi)膜癌是影響女性健康的常見惡性腫瘤，約占生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的30%，近年來發(fā)病率呈升高趨勢，且出現(xiàn)低齡化[1]。由于該腫瘤惡性程度高、侵襲力強、復發(fā)轉移率高[2]，已成為威脅女性健康的重要疾病。微小RNA(micro RNA，miRNA)作為機體內(nèi)廣泛存在的非編碼短鏈RNA[3]，在細胞增殖、分化、生長、凋亡、器官發(fā)育、代謝等多種生理過程中發(fā)揮重要作用[4-8]。研究表明，miRNA可發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用而參與多種惡性腫瘤發(fā)生、進展[9-12]。miR-15b是miR-15家族的重要成員，在調節(jié)細胞凋亡中發(fā)揮重要作用[13]。本研究對子宮內(nèi)膜癌組織中miR-15b表達進行分析，探討其與子宮內(nèi)膜癌患者臨床病理特征的關系，并通過上調子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細胞中miR-15b表達，觀察其對細胞增殖的影響，以期為子宮內(nèi)膜癌發(fā)病機制研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1一般資料選取2013年2月至2017年2月在新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院行子宮內(nèi)膜癌分期手術治療的87例患者為研究對象，年齡31～75(55.7±11.5)歲，均經(jīng)病理學檢查確診為子宮內(nèi)膜癌，且術前均未接受放射、化學治療。國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(federation international of gynecology and obstetrics，F(xiàn)IGO)分期[14]：Ⅰ～Ⅱ期71例，Ⅲ～Ⅳ期16例；組織學類型：Ⅰ型67例，Ⅱ型20例；組織分化程度：低分化31例，中高分化56例；肌層浸潤深度：≥1/2 肌層25例，<1/2肌層62例；發(fā)生淋巴結轉移15例，其中累及淋巴管13例?；颊呔羧⌒迈r子宮內(nèi)膜癌組織，置于液氮中保存于-80 ℃冰箱備用。同時，選取45例因子宮肌瘤行子宮全切術患者的正常子宮內(nèi)膜組織作為對照，年齡33～74(56.2±11.9)歲。2組患者年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準，研究對象均知情同意。

1.2細胞、試劑與儀器人子宮內(nèi)膜癌HEA-1A細胞購自中國科學院上海細胞學研究所；TRIzol總RNA提取試劑盒、Lipfectamine 2000轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司，達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基/F12培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium: nutrient mixture F-12，DMEM/F12)、胎牛血清、胰蛋白酶購自美國HyClone公司，miR-15b及內(nèi)參引物均由上海生工生物公司設計合成，miR-15b模擬物及對照序列均由福州邁新生物技術開發(fā)有限公司設計合成，反轉錄聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)試劑盒購自日本TaKaRa公司，四甲基偶氮唑藍(tetramethylazolazole blue，MTT)細胞增殖試劑盒購自南京建成生物工程研究所，Annexin V-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)/碘化丙錠(propidium iodide，PI)細胞凋亡檢測試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司，PI購自美國Sigma公司；實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司，流式細胞儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3實時熒光定量PCR檢測子宮內(nèi)膜癌和正常子宮內(nèi)膜組織中miR-15b表達取子宮內(nèi)膜癌和正常子宮內(nèi)膜組織，研磨后，加入細胞裂解液，用 TRIzol 總RNA提取試劑盒提取細胞中總RNA并檢測純度和濃度。取總RNA 2 μg，以miR-15b莖環(huán)結構：5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCA-ATTGCACTGGATACGACTGTAAAC-3′進行反轉錄，以cDNA為模板進行PCR。miR-15b上游引物序列為5′-ATGAACTTTCTCTGTCTTGG-3′，下游引物序列為5′-TCACCGCCTCGGCTTGTCACA-3′；U6上游引物序列為5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物序列為5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。PCR反應條件：92 ℃ 5 min，92 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，76 ℃ 30 s，連續(xù)36個循環(huán)；每個樣本均設3個平行反應復孔。采用2-△△Ct法計算子宮內(nèi)膜癌和正常子宮內(nèi)膜組織中miR-15b相對表達量。

1.4細胞培養(yǎng)與處理

1.4.1細胞培養(yǎng)和分組將人子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細胞置于含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，于含體積分數(shù)5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。待細胞融合度在80%以上時，胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞，利用Lipfectamine 2000轉染試劑盒進行轉染，根據(jù)轉染物不同分為miR-15b模擬物組、對照序列組和空白對照組。miR-15b模擬物組細胞轉染miR-15b模擬序列為5′-TGTAAACCATGATGTGCTGCTA-3′；對照序列組細胞轉染對照序列為5′-GTGTAACACGTCTATACGCCCA-3′；空白對照組細胞不作任何處理。轉染后繼續(xù)恒溫培養(yǎng)。

1.4.2實時熒光定量PCR檢測各組人子宮內(nèi)膜癌細胞中miR-15b表達取各組轉染后培養(yǎng)48 h細胞，加入細胞裂解液，其余操作步驟與“1.3項”相同。

1.4.3MTT法檢測各組人子宮內(nèi)膜癌細胞增殖能力取各組細胞，胰蛋白酶消化后，重懸成單細胞懸液，調整細胞密度為2×108L-1，按每孔100 μL細胞懸液接種于96孔板，繼續(xù)恒溫培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)12、24、48、72、96 h時，將20 μL MTT(5 g·L-1)加入各孔，孵育4 h，將孔內(nèi)上清液棄去，各孔加入 150 μL 二甲基亞砜，振蕩15 min，待結晶物完全溶解后，用酶標儀于570 nm波長處檢測吸光度值，并根據(jù)吸光度值判定細胞增殖能力。重復實驗3次。

1.4.4流式細胞術檢測各組人子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡率取各組細胞，胰蛋白酶消化后，調整細胞濃度為2×108L-1，將細胞接種于6孔板，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h，以1 500 r·min-1離心10 min，收集細胞，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)沖洗3次，用 1×結合緩沖液100 μL重懸細胞，分別加入Annexin V-FITC和PI各5 μL，室溫下避光孵育20 min，于 60 min 內(nèi)上機檢測細胞凋亡情況。

1.4.5流式細胞術檢測各組細胞周期取各組細胞，胰蛋白酶消化后，調整細胞濃度為2×108L-1，將細胞接種于6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，以1 500 r·min-1離心10 min，室溫下用體積分數(shù)70%乙醇固定60 min，以500 r·min-1離心5 min，加入PI和RNA酶，孵育60 min，于60 min內(nèi)上機檢測各組細胞周期。

2 結果

2.1子宮內(nèi)膜癌和正常子宮內(nèi)膜組織中miR-15b表達比較子宮內(nèi)膜癌組織和正常子宮內(nèi)膜組織中miR-15b相對表達量分別為1.32±0.13，2.49±0.16，子宮內(nèi)膜癌組織中miR-15b相對表達量低于正常子宮內(nèi)膜組織，差異有統(tǒng)計學意義(t=46.184，P<0.05)。

2.2子宮內(nèi)膜癌組織中miR-15b表達與患者臨床病理特征的關系結果見表1。子宮內(nèi)膜癌組織中miR-15b相對表達量與患者的年齡、組織學類型、分化程度、是否累及淋巴管和血管無關(P>0.05)，與FIGO分期、肌層浸潤深度和淋巴結轉移有關(P<0.05)。

表1子宮內(nèi)膜癌組織中miR-15b相對表達量與患者臨床病理特征的關系

2.3各組人子宮內(nèi)膜癌細胞中miR-15b表達比較miR-15b模擬物組、對照序列組和空白對照組人子宮內(nèi)膜癌細胞中miR-15b相對表達量分別為2.73±0.28、1.29±0.10和1.31±0.16，空白對照組與對照序列組miR-15b相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；miR-15b模擬物組人子宮內(nèi)膜癌細胞中miR-15b相對表達量高于空白對照組和對照序列組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4各組人子宮內(nèi)膜癌細胞增殖能力比較結果見表2?？瞻讓φ战M、對照序列組和miR-15b模擬物組細胞培養(yǎng)24、48、72、96 h時的增殖能力兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。miR-15b模擬物組人子宮內(nèi)膜癌細胞培養(yǎng)12 h時細胞增殖能力與空白對照組和對照序列組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。miR-15b模擬物組人子宮內(nèi)膜癌細胞培養(yǎng)24、48、72、96 h時細胞增殖能力低于空白對照組和對照序列組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；空白對照組與對照序列組細胞培養(yǎng)12、24、48、72、96 h時細胞增殖能力比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2不同培養(yǎng)時間3組人子宮內(nèi)膜癌細胞增殖能力比較

注：與培養(yǎng)12 h時比較aP<0.05；與培養(yǎng)24 h比較bP<0.05；與培養(yǎng)48 h比較cP<0.05； 與培養(yǎng)72 h比較dP<0.05；與空白對照組比較eP<0.05；與對照序列組比較fP<0.05。

2.5各組人子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡率比較結果見圖1。miR-15b模擬物組、對照序列組和空白對照組人子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡率分別為(15.5±3.0)%、(6.5±1.6)%和(8.1±2.6)%，3組人子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計學意義(F=22.090，P=0.000)。與空白對照組和對照序列組比較，miR-15b模擬物組人子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)?？瞻讓φ战M與對照序列組人子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，

A：空白對照組；B：對照序列組；C：miR-15b模擬物組。

圖1流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況

Fig.1Cellapoptosiswasdetectedbyflowcytometry

2.6各組人子宮內(nèi)膜癌細胞周期變化比較結果見表3和圖2。miR-15b模擬物組、對照序列組和空白對照組G0+G1、G2+M期細胞比例比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而S期細胞比例比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；空白對照組G0+G1、G2+M期細胞比例與對照序列組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與空白對照組和對照序列組比較，miR-15b模擬物組G0+G1期細胞比例顯著增加，而G2+M期細胞比例顯著減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表3各組人子宮內(nèi)膜癌細胞周期變化比較

Tab.3Comparisonofcellcyclechangesofendometrialcarcinomacellsineachgroup

組別G0+G1/%S/%G2+M/%空白對照組47.9±4.833.0±2.919.1±3.1對照序列組53.1±4.431.8±2.815.1±2.2miR-15b模擬物組63.3±3.6ab31.2±1.35.5±1.6abF19.7850.87247.107P0.0000.4380.000

注：與空白對照組比較aP<0.05；與對照序列組比較bP<0.05。

A：空白對照組；B：對照序列組；C：miR-15b模擬物組。

圖2流式細胞術檢測各組細胞周期變化

Fig.2Cellcyclechangeswasdetectedbyflowcytometryineachgroup

3 討論

子宮內(nèi)膜癌作為好發(fā)于絕經(jīng)后女性的常見惡性腫瘤，發(fā)病因素較為復雜，且近年來出現(xiàn)發(fā)病率升高、發(fā)病年齡年輕化趨勢[15]，同時，由于該腫瘤惡性程度高、侵襲力強，腫瘤復發(fā)、轉移率高，多數(shù)患者預后不良[16]。研究表明，子宮內(nèi)膜癌組織中miRNA表達譜發(fā)生改變，可能在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機制中發(fā)揮潛在作用[17]。miR-15b作為miRNA重要類型，參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，miR-15b既可以發(fā)揮抑癌基因功能參與胰腺癌[18]、口腔癌[19]等惡性腫瘤的發(fā)生，又可以作為癌基因參與胃癌、結直腸癌等惡性腫瘤的發(fā)生，提示miR-15b可能通過不同的調控機制而參與不同惡性腫瘤的發(fā)生。同時，miR-15b又可以作為判定腫瘤患者預后的標志物[20]。本研究結果顯示，子宮內(nèi)膜癌組織中miR-15b相對表達量低于正常子宮內(nèi)膜組織，說明miR-15b在子宮內(nèi)膜癌組織中呈低表達，提示miR-15b可能在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生中發(fā)揮抑癌基因的功能。

本研究結果顯示，子宮內(nèi)膜癌組織中miR-15b相對表達量與FIGO分期、肌層浸潤深度和淋巴結轉移有關，在FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期、肌層浸潤深度≥1/2肌層和發(fā)生淋巴結轉移的子宮內(nèi)膜癌組織中呈低表達，說明miR-15b參與了子宮內(nèi)膜癌病程進展，隨著子宮內(nèi)膜癌病情進展，miR-15b表達逐漸減少，進一步提示miR-15b可能在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生中發(fā)揮抑癌基因的功能。本研究為進一步探討miR-15b在子宮內(nèi)膜癌進程中的作用，采用轉染miR-15b模擬物的方式提高子宮內(nèi)膜癌細胞中miR-15b的表達，結果顯示，miR-15b模擬物組子宮內(nèi)膜癌細胞中miR-15b相對表達量顯著增加，提示構建的細胞模型成功。MTT實驗結果顯示，與空白對照組和對照序列組比較，miR-15b模擬物組子宮內(nèi)膜癌細胞培養(yǎng)24、48、72、96 h時細胞增殖能力降低，說明上調子宮內(nèi)膜癌細胞中miR-15b表達可有效降低細胞增殖能力。本研究結果顯示，miR-15b模擬物組子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡率顯著高于空白對照組和對照序列組，說明上調子宮內(nèi)膜癌細胞中miR-15b表達可促進細胞凋亡。進一步對細胞周期進行檢測顯示，miR-15b模擬物組子宮內(nèi)膜癌細胞G0+G1期細胞比例顯著增加，說明上調miR-15b可能通過細胞周期阻滯而最終促進細胞凋亡的發(fā)生。

綜上所述，miR-15b在子宮內(nèi)膜癌組織中呈低表達，且參與了子宮內(nèi)膜癌病程進展，上調子宮內(nèi)膜癌細胞中miR-15b表達可抑制細胞增殖，其機制可能與阻滯細胞周期及促進細胞凋亡有關。

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