李偉偉，耿曉松，孫建偉，段樹鵬，宋新文，申保生

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院感染疾病科，河南 衛(wèi)輝 453100；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院護理學院，河南 新鄉(xiāng) 453003；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院科研科，河南 衛(wèi)輝 453100)

DEK蛋白是一種普遍存在的可磷酸化的染色質架構蛋白[1]。目前，DEK被確認為是一種癌基因，DEK過度表達可能參與了細胞中致癌基因的突變，導致癌癥的發(fā)生、發(fā)展[2]。關于DEK在肝癌細胞中的作用及功能，目前國內外文獻報道尚少。因此，本研究應用RNA干擾技術下調人肝癌細胞株HepG2細胞中DEK表達，研究其表達下調對HepG2細胞增殖、細胞周期分布的影響，并探討可能的分子機制，為治療肝癌提供新的檢測、診斷和治療方法。

1 材料與方法

1.1材料人肝癌細胞株HepG2購自中國科學院上海細胞庫，RPMI-1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶、胎牛血清、LipofectamineTM2000脂質體轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司，DEK引物由南京凱基生物公司合成，抗體DEK、細胞周期素D1(Cyclin D1)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗均購自美國Santa Cruz公司，Annexin V-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)凋亡檢測試劑盒購自美國Biovision公司。實時定量聚合酶鏈反應(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)儀購自新加坡Life Technologices公司，流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及分組HepG2細胞為貼壁細胞，置于含體積分數(shù)10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。待細胞生長至90%融合度時分為空白對照組、小分子干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)對照組和DEK siRNA組。空白對照組細胞正常培養(yǎng)，不做任何處理；siRNA對照組和DEK siRNA組細胞分別在LipofectamineTM2000脂質體介導下進行siRNA表達載體和DEK siRNA表達載體轉染。

1.2.2RT-PCR檢測HepG2細胞中DEKmRNA表達收集各組HepG2細胞，按照TRIzol RNA試劑盒說明書步驟操作，反轉錄成cDNA，然后以cDNA為模板，以熒光定量PCR的方法擴增DEK mRNA，RT-PCR檢測各組細胞中DEK mRNA的表達。DEK引物序列：上游為5′-AACGTGGGTCAGTTC-AGTGGC-3′，下游為5′-TTCGCTGTTCACGCCTGACCT-3′。GAPDH引物序列：上游為5′-GCGTCG-TCGACAACGGCTC-3′，下游為5′-CAAACATGATCTGGGTCATCTTTC-3′。PCR 反應條件：95 ℃ 1 min、95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)。實驗重復3次，計算Ct值，采用2-△△Ct法進行計算分析。

1.2.3免疫蛋白印跡法(Westernblot)檢測HepG2細胞中DEK和CyclinD1蛋白表達收集轉染48 h后的各組HepG2細胞，按說明書提取總蛋白，二辛可酸(bicinchoninic acid，BCA)法測蛋白濃度。凝膠電泳后轉印至聚偏二氟乙烯膜上，用含質量分數(shù)5%的脫脂牛奶于常溫下封閉l h，分別加入稀釋過的磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)、DEK、CyclinD1一抗，于4 ℃下孵育過夜。次日洗膜后，加入對應的第二抗體孵育90 min，增強型化學發(fā)光試劑顯影、定影。采用Quantity One軟件分析蛋白表達灰度值，蛋白相對表達水平為目的基因灰度值與內參基因灰度值的比值，以GAPDH為內參。

1.2.4四甲基偶氮唑鹽(methylthiazolyltetrazolium，MTT)法檢測HepG2細胞增殖取對數(shù)生長期HepG2細胞，按每孔5×104個細胞接種于96孔板，繼續(xù)培養(yǎng)并進行轉染，每組設4個復孔，同時設空白對照，分別于轉染后24、48、72、96、120 h加入 5 g·L-1的MTT溶液 20 mL，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，棄去上清液，每孔加入二甲基亞砜150 μL，震蕩使結晶溶解混勻后，以空白孔為對照，酶標儀490 nm波長讀取各孔吸光度值，吸光度值越高，代表細胞增殖能力越強。

1.2.5流式細胞儀檢測細胞周期收集轉染48 h后的各組HepG2細胞，800 r·min-1離心10 min，4 ℃ 下體積分數(shù)70%乙醇固定細胞過夜，磷酸鹽緩沖液洗滌3次，加入1 g·L-1核糖核酸酶(ribonuclease，RNase)200 μL，37 ℃溫育30 min，加入PI染液1 mL，4 ℃避光放置30 min后進行流式細胞儀檢測。

2 結果

2.13組HepG2細胞中DEKmRNA及DEK、CyclinD1蛋白表達比較結果見圖1和表1?？瞻讓φ战M、siRNA對照組和DEK siRNA組HepG2細胞中DEK mRNA及DEK、CyclinD1蛋白表達總體比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；DEK siRNA組HepG2細胞中DEK mRNA及DEK、CyclinD1蛋白表達低于空白對照組和siRNA對照組，差異均有統(tǒng)計學意義

(P<0.05)；空白對照組和siRNA對照組HepG2細胞中DEK mRNA及DEK、CyclinD1蛋白表達比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1：空白對照組；2：siRNA對照組；3：DEK siRNA組。

圖1轉染48h后3組HepG2細胞中DEK和CyclinD1蛋白表達

Fig.1ExpressionofDEKandCyclinD1proteininHepG2cellsafter48htransfectioninthethreegroups

表13組HepG2細胞中DEKmRNA及DEK、CyclinD1蛋白表達比較

注：與空白對照組和siRNA對照組比較aP<0.05。

2.23組HepG2細胞增殖能力比較結果見表2。DEK siRNA組轉染后24、48、72、96、120 h的細胞增殖能力均低于空白對照組和siRNA對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；空白對照組和siRNA對照組各時間點細胞增殖能力比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表23組HepG2細胞增殖能力比較

注：與空白對照組和siRNA對照組比較aP<0.05。

2.33組HepG2細胞的細胞周期比較結果見表3。DEK siRNA組G0+G1期細胞所占比例高于空白對照組和siRNA對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；DEK siRNA組S期、G2+M期細胞所占比例均低于空白對照組和siRNA對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；空白對照組和siRNA對照組G0+G1期、S期、G2+M期細胞所占比例比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.4CyclinD1蛋白表達與DEKmRNA和DEK蛋白表達的相關性Pearson相關性分析結果顯示，CyclinD1蛋白表達與DEK mRNA和DEK蛋白表達均呈正相關(r=0.909、0.899，P<0.05)。

表33組HepG2細胞的細胞周期分布比較

注：與空白對照組和siRNA對照組比較aP<0.05。

3 討論

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界第5大常見腫瘤，進展迅速，預后較差，在癌癥相關病死率中排名第3[3-4]。DEK作為一種新的DNA 拓撲結構調節(jié)蛋白，位于染色體6p22.3，由375個氨基酸殘基組成。人類的DEK蛋白最初發(fā)現(xiàn)于一種急性髓細胞系白血病，且DEK可作為自身抗原出現(xiàn)在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕關節(jié)炎等自身免疫性疾病[5-6]。DEK蛋白與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關系密切，可通過多種途徑調控細胞的增殖、分化、凋亡、遷移等過程。YU等[7]研究發(fā)現(xiàn)，DEK在肝癌細胞系(SMMC7721、HepG2、Hep3B、MHCC97L、MHCC97H)中的表達顯著高于正常肝細胞HL7702；林黎娟等[8]研究發(fā)現(xiàn)，HCC組織中DEK蛋白陽性表達顯著高于癌旁肝組織，且HCC組織中DEK蛋白陽性表達與組織分化程度及淋巴結轉移密切相關；提示DEK蛋白與HCC進展密切相關。siRNA技術是目前腫瘤基因領域常用的研究手段。本研究應用DEK siRNA轉染人肝癌細胞株HepG2，結果顯示，HepG2細胞中DEK mRNA和蛋白表達均下調，說明siRNA可以特異性下調靶基因的表達，進而影響細胞的生物學特性，具有高效性、特異性。

細胞癌變與增殖失控具有明確的關系，細胞周期主要分為G1、S、G2和M期，遵循G1→S→G2→M的發(fā)展規(guī)律，是細胞生命活動的基本過程，細胞一旦從G1期進入S期則可自動完成分裂過程[9]。Cyclin D1是G1期進展的限速控制因素，能夠抑制細胞進入S期進行DNA復制和分裂[10]。研究表明，DEK主要在增殖活躍的細胞和癌細胞中高表達，外周血來源的正常淋巴細胞被有絲分裂原刺激增生后，DEK表達顯著上調[11]；乳腺癌組織和細胞系中DEK均為高表達狀態(tài)[5]；轉移性黑素瘤中DEK表達高于良性痣[12]；張彩鳳等[13]應用特異性siRNA沉默胃癌SGC-7901細胞DEK表達后，通過細胞計數(shù)試劑盒檢測，發(fā)現(xiàn)SGC-7901細胞增殖能力降低；劉巋然等[14]將表達DEK siRNA的重組質粒psiRNA-hHDEK轉染宮頸癌CaSki細胞后，發(fā)現(xiàn)細胞增殖抑制率顯著升高。本研究結果顯示，特異性DEK siRNA下調HepG2細胞中DEK表達后，HepG2細胞增殖能力降低，G0+G1期細胞比率升高，S期及G2+M期細胞比率降低，與上述研究結果一致。相關性分析顯示，DEK基因表達下調后，Cyclin D1基因表達出現(xiàn)同步下調，提示DEK siRNA可能通過抑制Cyclin D1蛋白表達而抑制腫瘤細胞的生長，但其具體機制及是否存在相關信號通路有待進一步深入研究。

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