朱正軍，萬(wàn)端極，盧揚(yáng)成，謝逾群，徐 斌，張愛(ài)帝，陳茂彬，曹敬華*

（1.湖北工業(yè)大學(xué) 發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心 湖北省工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430068；2.房縣黃酒和發(fā)酵產(chǎn)業(yè)局，湖北 十堰 442100）

黃酒是以谷物為原料，利用酒藥、麥曲或米曲所含的多種微生物參與釀制而成的一種低酒精度發(fā)酵原酒[1]，保留了發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的各種營(yíng)養(yǎng)成分、風(fēng)味成分[2]和活性物質(zhì)[3]，其風(fēng)味獨(dú)特，在中國(guó)及東南亞廣受消費(fèi)者喜愛(ài)[4]。我國(guó)黃酒的品種很多，以紹興黃酒、即墨老酒、上海老酒等為代表，根據(jù)釀造原輔料、糖化發(fā)酵劑和生產(chǎn)工藝等的不同，產(chǎn)品風(fēng)格也各不相同[5]。

房縣黃酒具有區(qū)別于紹興黃酒和上海黃酒等的獨(dú)特產(chǎn)品特點(diǎn)，含有豐富的氨基酸、多肽、多酚等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，主要風(fēng)味物質(zhì)為β-苯乙醇、乳酸乙酯、異戊醇、異丁醇、乙酸乙酯、正丙醇和丁二酸二乙酯等，具有高β-苯乙醇和低異戊醇的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)。

房縣黃酒發(fā)酵采用典型的邊糖化邊發(fā)酵的方法，使用自產(chǎn)小曲，發(fā)酵過(guò)程中不加麥曲，不加純酵母，酒體乳白色或淡黃色，米香濃郁，具有黃酒特有的醇香，酒體鮮甜、甘冽，爽凈，沁人心脾。目前，對(duì)傳統(tǒng)房縣黃酒釀造工藝的研究十分匱乏，房縣黃酒主要是以經(jīng)驗(yàn)和作坊式工藝釀酒，缺乏科學(xué)、系統(tǒng)的理論研究基礎(chǔ)。本試驗(yàn)通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)對(duì)傳統(tǒng)房縣黃酒釀造工藝進(jìn)行研究和優(yōu)化，以期為房縣黃酒的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糯米、酒藥：房縣黃酒和發(fā)酵產(chǎn)業(yè)局；硫酸、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、葡萄糖、酚酞、次甲基藍(lán)（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AR1140電子分析天平：奧克斯國(guó)際貿(mào)易有限公司；PHX智能生化恒溫培養(yǎng)箱：寧波萊?？萍加邢薰?；FE-20pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；2004酒精計(jì)：余姚儀表二廠有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 房縣黃酒加工工藝流程

1.3.2 操作要點(diǎn)

①浸米：糯米用水浸泡5～8 h至米粒充分吸水。

②蒸煮：將浸泡后的糯米瀝干水分，0.05MPa蒸煮20min。③攤涼：蒸熟的糯米攤涼降溫至28～30℃。

④糖化：加入0.4%～0.6%酒藥和40%～60%水，在陶缸中拌勻搭窩，25～28℃糖化36～48 h。

⑤發(fā)酵：糖化之后將醪液混勻，22～30℃發(fā)酵15～27d。

⑥滅菌：發(fā)酵結(jié)束后，立即將罐中物料轉(zhuǎn)移出進(jìn)行壓榨，獲得酒液。酒液室溫靜置澄清24 h，然后65℃煎酒滅菌20～30 min。

1.3.3 理化指標(biāo)測(cè)定

總糖、非糖固形物、酒精度、總酸、氨基酸態(tài)氮、β-苯乙醇、異戊醇的測(cè)定參見(jiàn)國(guó)標(biāo)GB/T 13662—2008《黃酒》中的方法進(jìn)行[6]。

1.3.4 氨基酸含量測(cè)定

取10 mL樣品加入10%磺基水楊酸10 mL混合均勻，于4℃放置2 h，1 000 r/min離心15 min，中速濾紙過(guò)濾后，用4 mol/L NaOH調(diào)整濾液pH值至8.0，并定容至25 mL，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，用AccQ·FluorReagentKit（P/NWAT 052880）進(jìn)行衍生處理后，用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）外標(biāo)法測(cè)定樣品中的游離氨基酸含量[7]。

1.3.5 感官評(píng)定方法

選擇專(zhuān)業(yè)品評(píng)人員（10人）按照表1的感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)房縣黃酒進(jìn)行打分，結(jié)果取10人的平均分，滿(mǎn)分為100分[8]。

表1 房縣黃酒的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards of Fangxian rice wine

1.3.6 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別考察酒藥接種量（0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%）、料水比（1∶0.3、1∶0.4、1∶0.5、1∶0.6、1∶0.7（g∶mL））、發(fā)酵時(shí)間（15 d、18 d、21 d、24 d、27 d）、發(fā)酵溫度（22 ℃、24 ℃、26 ℃、28℃、30℃）對(duì)房縣黃酒中異戊醇、β-苯乙醇、酒精度及其感官評(píng)分的影響。

1.3.7 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以酒藥接種量（A）、料水比（B）、發(fā)酵溫度（C）、發(fā)酵時(shí)間（D）為影響因素，以感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)對(duì)傳統(tǒng)房縣黃酒的釀造工藝進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表2。

表2 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation technology optimization

2 結(jié)果與分析

2.1 酒藥接種量對(duì)黃酒發(fā)酵的影響

圖1 接種量對(duì)β-苯乙醇和異戊醇含量的影響Fig.1 Effect of inoculum on β-phenylethanol and isoamyl alcohol contents

圖2 接種量對(duì)感官評(píng)分和酒精度的影響Fig.2 Effect of inoculum on sensory score and alcohol content

β-苯乙醇是稻米類(lèi)黃酒在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的特征性成分，以原料中的氨基酸為底物，利用Erlich反應(yīng)產(chǎn)生，β-苯乙醇具有玫瑰花香和蜂蜜香，為黃酒帶來(lái)悅?cè)讼銡鈁9-10]。飲用黃酒易“上頭”，主要原因是發(fā)酵過(guò)程中微生物代謝所產(chǎn)生的高級(jí)醇如異戊醇、異丁醇含量過(guò)高[11-12]，有研究指出[13]，高級(jí)醇在人體內(nèi)的代謝速度比乙醇慢，在機(jī)體內(nèi)停留時(shí)間長(zhǎng)，造成更持久的刺激。從圖1可知，房縣黃酒擁有較高的β-苯乙醇含量和較低的異戊醇含量，酒藥接種量為0.5%時(shí)，β-苯乙醇含量最高，酒藥接種量為0.4%時(shí)，異戊醇含量最低。從圖2可知，隨著酒藥接種量增加，酒精度含量逐漸升高，而感官評(píng)分在接種量為0.5%時(shí)最高，該黃酒米香濃郁、鮮甜爽凈，而過(guò)高和過(guò)低的接種量都會(huì)導(dǎo)致黃酒的色澤變差，出現(xiàn)異香異味。綜合考慮，選擇酒藥接種量為0.5%。

2.2 料水比對(duì)黃酒發(fā)酵的影響

圖3 料水比對(duì)β-苯乙醇和異戊醇的影響Fig.3 Effect of material-liquid ratio on β-phenylethanol and isoamyl alcohol contents

圖4 料水比對(duì)感官評(píng)分和酒精度的影響Fig.4 Effect of material-liquid ratio on sensory score and alcohol content

傳統(tǒng)房縣黃酒在釀造過(guò)程中加水量少，醪液濃稠，含糖量高。由圖3可知，隨著料水比的增加，β-苯乙醇含量逐漸增高，異戊醇含量先降低后升高，在料水比1∶0.5（g∶mL）時(shí)最低，為71.6 mg/L，當(dāng)加水量較少時(shí)，發(fā)酵醪液糖度很高，酵母生長(zhǎng)代謝受到抑制，導(dǎo)致β-苯乙醇和異戊醇含量降低，而當(dāng)加水量增加時(shí)，發(fā)酵醪液得到稀釋?zhuān)湍干L(zhǎng)代謝旺盛，β-苯乙醇和異戊醇含量則隨之增加。由圖4可知，加水量越高，酒精度越高，但較低和較高的料水比所釀造的房縣黃酒感官評(píng)分都不高，酒體存在或酸或過(guò)甜等缺陷，在料水比為1∶0.5（g∶mL）時(shí)，感官評(píng)分達(dá)到93分，酒體風(fēng)格典型，口感諧調(diào)。綜合考慮，選擇料水比為1∶0.5（g∶mL）。

2.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)黃酒發(fā)酵的影響

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)β-苯乙醇和異戊醇的影響Fig.5 Effect of fermentation time on β-phenylethanol and isoamyl alcohol contents

圖6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)感官評(píng)分和酒精度的影響Fig.6 Effect of fermentation time on sensory score and alcohol content

隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵過(guò)程中的微生物從大量增殖到趨于平穩(wěn)、衰亡。由圖5可知，β-苯乙醇含量逐漸增加，在24 d后開(kāi)始下降，可能是因?yàn)榍捌诎l(fā)酵微生物增殖代謝活動(dòng)旺盛，到發(fā)酵后期，酵母衰亡等原因?qū)е缕洚a(chǎn)量不再增加甚至下降；異戊醇含量在27 d時(shí)有所增加，可能是因?yàn)榘l(fā)酵后期酵母自溶所導(dǎo)致。由圖6可知，酒精度隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)不斷上升，前21d內(nèi)上升趨勢(shì)較大，21 d后上升趨勢(shì)趨于平緩；發(fā)酵時(shí)間為21 d時(shí)，感官評(píng)分最高，考慮到發(fā)酵21 d時(shí)β-苯乙醇、異戊醇含量以及酒精度均處于較理想狀態(tài)，因此選擇發(fā)酵時(shí)間為21 d。

2.4 發(fā)酵溫度對(duì)黃酒發(fā)酵的影響

作為酵母生長(zhǎng)繁殖重要條件的發(fā)酵溫度直接影響酒精的生成量和黃酒的質(zhì)量[14]。酒精酵母最適生長(zhǎng)溫度為25～30℃，溫度低、繁殖慢，溫度高、繁殖快[15]。由圖7可知，隨著發(fā)酵溫度的增加，β-苯乙醇和異戊醇含量均呈上漲趨勢(shì)，其中β-苯乙醇在發(fā)酵溫度為28℃時(shí)達(dá)最高達(dá)到158.3mg/L。由圖8可知，隨著前酵溫度的升高，酒精度先升高后下降，溫度為26℃時(shí)，酒精度最高，感官評(píng)分也最高。溫度較低時(shí)，酵母繁殖代謝緩慢，糖轉(zhuǎn)換成乙醇的速度緩慢；當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，酵母容易衰老和死亡，其繁殖和代謝能力下降，從而喪失對(duì)雜菌的抑制優(yōu)勢(shì)，容易導(dǎo)致乙醇產(chǎn)生的能力下降以致酒液品質(zhì)的下降。綜合考慮，選擇發(fā)酵溫度為26℃。

圖7 發(fā)酵溫度對(duì)β-苯乙醇和異戊醇的影響Fig.7 Effect of fermentation temperature on β-phenylethanol and isoamyl alcohol contents

圖8 發(fā)酵溫度對(duì)感官評(píng)分和酒精度的影響Fig.8 Effect of fermentation temperature on sensory score and alcohol content

2.5 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)酒藥接種量、料水比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn)優(yōu)化，試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。

由表3極差分析結(jié)果可知，對(duì)傳統(tǒng)房縣黃酒感官品質(zhì)影響的大小順序?yàn)榫扑幗臃N量＞發(fā)酵溫度＞料水比＞發(fā)酵時(shí)間。傳統(tǒng)房縣黃酒的最佳工藝條件組合為A2B2C3D3，即酒藥接種量0.5%，料水比1∶0.5（g∶mL），發(fā)酵溫度28 ℃，發(fā)酵時(shí)間24 d。由表4可知，酒藥接種量和發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)品感官評(píng)分的影響均為顯著（P＜0.05）。在此工藝條件下，進(jìn)行傳統(tǒng)房縣黃酒最優(yōu)發(fā)酵工藝的驗(yàn)證試驗(yàn)，獲得傳統(tǒng)房縣黃酒的β-苯乙醇含量為168.2 mg/L，異戊醇含量為63.5 mg/L，酒精度為17.6%vol，感官評(píng)分為94分。

表3 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation technology optimization

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results

2.6 理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

對(duì)最佳工藝條件下的房縣黃酒進(jìn)行理化指標(biāo)檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，房縣黃酒總糖為154.6 g/L，總酸為7.5 g/L，非糖固形物為32.6 g/L，具有“高糖、高酸、高固形物”的特點(diǎn)，加之房縣黃酒多采用山泉水為釀造用水，這形成了與其他品種黃酒截然不同的產(chǎn)品特點(diǎn)。

表5 房縣黃酒理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果Table 5 Determination results of the physical and chemical indexes of Fangxian rice wine

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)傳統(tǒng)房縣黃酒的釀造工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定其最優(yōu)釀造工藝為酒藥接種量0.5%，料水比1∶0.5（g∶mL），發(fā)酵溫度28 ℃，發(fā)酵時(shí)間24 d。在此條件下釀造得到的房縣黃酒米香濃郁，柔和甘冽，酒體諧調(diào)，具有獨(dú)特的產(chǎn)品風(fēng)格，酒精度為17.6%vol、β-苯乙醇含量為168.2 mg/L、異戊醇含量為63.5 mg/L、總糖為154.6 g/L、總酸為7.5g/L、非糖固形物為32.6 g/L、氨基酸態(tài)氮為0.47 g/L，氨基酸含量為228.3 mg/L。

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