陳瑩

（貴陽市第一人民醫(yī)院病理科 貴州 貴陽 550001）

缺血后處理是指組織或器官發(fā)生缺血后，在長時間再灌注之前進行數(shù)次短暫缺血/再灌注循環(huán)，從而減輕再灌注損傷的一種保護作用。肺缺血后處理的研究起步較晚，其保護機制還未確定。因此本實驗通過建立肺缺血/再灌注損傷模型，探討缺血后處理在肺I/R損傷中的保護作用及其可能機制。

1.材料和方法

1.1 實驗分組

成年SD大鼠60只，雌雄不拘，并隨機分為3組，每組20只。10%水合氯醛腹腔麻醉，氣管插管，接動物呼吸機。（1）sham組：開胸后游離左側肺門，不予其它處理；（2）I/R組：開胸后于肺充盈末用無創(chuàng)微血管夾夾閉左側肺門，45min后松開微血管夾，灌注180min；（3）IPO組：處理同I/R組，但在松開微血管夾即刻，采取復灌30s、停灌30s，連續(xù)6個循環(huán)，作為缺血后處理，之后再灌注180min。

1.2 標本的采集與處理

再灌注結束后，立即取出左肺，切取中段肺組織，置于福爾馬林中固定，以供HE染色、免疫組化及細胞凋亡檢測。

1.3 觀察指標

1.3.1 病理學觀察

常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色。

1.3.2 肺濕/干重之比

取出稱重的凍存肺組織，放置電熱恒溫鼓風干燥箱中，溫度80℃，連續(xù)烘烤24h至恒重后取出，用電子天平稱重，肺組織濕重／干重比值=（濕重-干重）／干重。

1.3.3 肺組織Bax、Bcl-2表達

采用鏈酶親和素一生物素一過氧化物酶（SABC）法，嚴格按試劑盒說明書操作結果判定：胞漿呈棕黃色顆粒狀的為陽性細胞。在400倍顯微鏡下隨機取5個視野，計數(shù)陽性細胞數(shù)及細胞總數(shù)，計算陽性細胞率。

1.3.4 細胞凋亡的檢測

嚴格按照試劑盒說明書進行。在400×顯微鏡下隨機取5個視野，計數(shù)陽性細胞數(shù)及細胞總數(shù)，計算凋亡指數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學處理方法

所有數(shù)據(jù)用±表示，用SPSS統(tǒng)計學軟件作統(tǒng)計學分析，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為顯著性差異。

2.結果

2.1 病理學觀察

光鏡下可見sham組肺泡結構清晰，無水腫、出血。與I/R組相比IPO組的細胞損傷程度較I/R組明顯減輕。

2.2 肺組織濕重／干重比值

肺濕重／干重比值是反映肺組織水腫程度，特別是肺泡內(nèi)水腫的常用指標。表l結果提示IPO能夠減輕肺I/R損傷所引起的肺水腫。

表1 各組肺組織濕重／干重比值的變化（±s）

表1 各組肺組織濕重／干重比值的變化（±s）

與Sham組比▲P＜0.05；與I/R組比△P＜0.05

組別 例數(shù)（n） 肺濕/干重比sham組 20 3.98±0.01△I/R組 20 8.33±0.64▲IPO組 20 4.32±0.46▲△

2.3 細胞凋亡指數(shù)

如表2所示與I/R組相比，IPO組肺組織細胞凋亡指數(shù)明顯減少。該項結果表明：I/R損傷可促進細胞凋亡的發(fā)生，而IPO則可顯著降低該項指標的陽性細胞數(shù)。

2.4 肺組織中Bcl-2和Bax表達的陽性細胞率：

從表2中可知，與I/R組比較，IPO組的Bcl-2表達顯著升高而Bax表達明顯降低。

表2 各組肺細胞凋亡指數(shù)以及Bax與Bcl-2陽性細胞率的比較

3.討論

IPO是指組織在長時間缺血后再灌注前反復短暫再缺血處理所誘發(fā)的一種內(nèi)源性保護機制。由于IPO操作簡單，時機易于掌握，目前已得到臨床上的高度關注。肺缺血后處理的研究相對較少，其是否可減輕肺I/R損傷還未確定。因此本實驗通過復制IPO模型，即在長時間再灌注以前，采取復灌30s、停灌30s，連續(xù)6個循環(huán)的處理作為IPO組。結果與I/R組相比，IPO組的病理學改變減輕，肺濕/干重比顯著降低。這些結果提示：IPO同樣可減輕肺I/R損傷。

早期研究多認為肺功能障礙主要與肺組織細胞壞死有關，而近年來的實驗研究[1]卻表明，繼發(fā)于I/R的凋亡細胞數(shù)量與細胞氧化損傷呈顯著相關。缺血/再灌注后出現(xiàn)的氧化損傷、鈣超載及能量代謝障礙等均會導致細胞凋亡增加。缺血后處理則可通過激發(fā)機體自身防護系統(tǒng)而抑制細胞凋亡的發(fā)生，如降低線粒體膜通透性、阻止促凋亡蛋白從線粒體向外釋放和抑制Caspases的激活[2]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，I/R組肺組織的細胞凋亡指數(shù)顯著高于Sham組，而IPO組的細胞凋亡指數(shù)則較I/R組顯著減低。該結果提示IPO具有明顯的抗凋亡作用。

細胞凋亡的發(fā)生與Bcl-2和Bax表達密切相關。Bcl-2和Bax都是Bcl-2家族的成員，Bcl-2蛋白家族表達的異常直接調控著凋亡的發(fā)生。Bcl-2抑制細胞凋亡的作用與抗氧化、抑制Ca2+內(nèi)流等因素有關，其通過抑制細胞信號傳遞而發(fā)揮抑制細胞凋亡、延長細胞壽命的作用。最近有文獻提出Bcl-2還能抑制趨化因子巨噬細胞炎性蛋白（macrophage inflammatory protein-2，MIP-2）的升高，從而參與I/R后炎癥反應的抑制作用。而Bax基因則可通過對抗Bcl-2蛋白抑制凋亡的作用發(fā)揮效應。細胞對死亡信號的敏感性取決于胞內(nèi)Bcl-2/Bax競爭性的二聚體化過程。Bax同二聚體形成便可誘導凋亡；隨Bcl-2蛋白表達量的上升，越來越多的Bax同二聚體分開，與Bcl-2形成比Bax/Bax更穩(wěn)定的Bcl-2/Bax二聚體，拮抗了Bax/Bax誘導凋亡的作用，則細胞不發(fā)生凋亡[2]。從本實驗中我們可以看出：IPO能明顯增加Bcl-2的表達和抑制Bax的表達，使Bcl-2/Bax的比值升高，從而使細胞凋亡指數(shù)減少。

綜上所述，本研究顯示缺血后處理能較好保護I/R損傷后的肺組織結構，減輕肺水腫，并且具有顯著的抗凋亡作用。其抗凋亡的機制應該與上調Bcl-2表達與抑制Bax表達，使Bcl-2/Bax的比值升高有關。

[1]Zhang J，Wu Y，Weng Z，et al.Glycyrrhizin protects brain against ischemia-reperfusion injury in mice through HMGB1-TLR4-IL-17A signalingpathway[J].Brain Res，2014，1582：176-186.

[2]Zhang J,Wu Y,Weng Z,et al.Glycyrrhizin protects brain against ischemia-reperfusion injury in mice through HMGB1-TLR4-IL-17A signaling pathway[J].Brain Res,2014,1582:176-186.

[3]董福強,田軼魁,魏民新,張鑫.缺血后處理對大鼠心肌細胞凋亡及Bcl-xl/s的影響[J].天津醫(yī)藥,2011(12).

[4]徐曉娜,方蓮花,杜冠華.心肌缺血再灌注損傷過程中Bcl-2調控自噬的研究進展[J].中國藥學雜志,2014(05).

[5]黃婷,李紹旦,楊明會,劉毅.大鼠心肌缺血再灌注實驗技巧的經(jīng)驗總結[J].中國比較醫(yī)學雜志,2017(09).