于東渤　張紅嬌　蘇春玉　余斯琦　朱長軍　董智雄

摘 要：目的 為了探究人驅(qū)動蛋白分子Kif4A在有絲分裂過程中的作用及其調(diào)節(jié)機(jī)制，需要在體外表達(dá)并純化有活性的Kif4A蛋白。方法 構(gòu)建了驅(qū)動蛋白Kif4A的體外真核表達(dá)載體pFastBac-Kif4A，將其轉(zhuǎn)化到DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中，通過藍(lán)白斑篩選得到陽性克隆，抽提得到桿狀病毒基因組。由于桿狀病毒基因組較大，標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染效率較低，對該方法進(jìn)行了優(yōu)化。將桿狀病毒基因組通過標(biāo)準(zhǔn)的和優(yōu)化的轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染到草地夜蛾卵巢細(xì)胞SF9中，經(jīng)培養(yǎng)得到表達(dá)驅(qū)動蛋白Kif4A的初代桿狀病毒。結(jié)果 通過檢測初代桿狀病毒的滴度， 我們發(fā)現(xiàn)，與標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)染方法相比，優(yōu)化的轉(zhuǎn)染方法所得到的初代桿狀病毒的滴度更高，相同稀釋度感染條件下表達(dá)的Kif4A蛋白水平更高。結(jié)論 本研究成功構(gòu)建了Kif4A桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，并優(yōu)化了SF9細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法，為后續(xù)大量表達(dá)和純化Kif4A蛋白奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：驅(qū)動蛋白 Kif4A 桿狀病毒 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染

中圖分類號：Q291 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1672-3791（2018）09（c）-0235-05

昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是一種以昆蟲桿狀病毒為外源基因表達(dá)載體，昆蟲細(xì)胞作為表達(dá)受體的外源基因真核表達(dá)系統(tǒng)[1]。與原核表達(dá)系統(tǒng)相比，昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有安全性好、重組蛋白表達(dá)量高、重組蛋白翻譯后加工等特點，因而得到了廣泛的應(yīng)用。這種表達(dá)系統(tǒng)除了可以大量高效的表達(dá)所需要的目的蛋白，同時在表達(dá)過程中可以進(jìn)行翻譯后修飾，使目的蛋白的免疫原性、ATP酶活性等生物活性與天然蛋白基本相同[2]。因此，應(yīng)用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行目的蛋白的表達(dá)，可以大量高效的得到與天然蛋白基本相同的蛋白質(zhì)。

驅(qū)動蛋白分子（Kinesin）是細(xì)胞內(nèi)以微管為軌道的通過水解ATP進(jìn)行移動的馬達(dá)蛋白。此類蛋白分子是細(xì)胞內(nèi)主要的運輸工具，不僅在細(xì)胞中起著運輸?shù)墓δ?，而且對?xì)胞有絲分裂過程起極其重要的作用。Kif4A是kinesin-4家族成員，基因定位于人類染色體Xq13.1，cDNA長度為3699bp，編碼1232個氨基酸，蛋白相對分子量約140kDa。與其他驅(qū)動蛋白分子相同，Kif4A蛋白也由3個保守的功能域組成：N端球形的馬達(dá)結(jié)構(gòu)域（motor domain）；中央卷曲螺旋桿狀結(jié)構(gòu)域（stalk domain），和C端扇形的尾部（tail domain）。在細(xì)胞中Kif4A通過中間的桿狀螺旋區(qū)形成同源二聚體；通過C端的尾部結(jié)合相應(yīng)的“貨物”；通過N 端球形結(jié)構(gòu)域結(jié)合到微管上，向微管的正極末端移動。在有絲分裂過程中Kif4A功能的發(fā)揮依賴于有絲分裂過程中蛋白激酶的磷酸化調(diào)節(jié)。在有絲分裂早期，Kif4A主要受CDK1激酶磷酸化修飾，修飾發(fā)生在T1161位點，修飾后的Kif4A定位于染色體上，參與染色體的凝集和中板集合，在有絲分裂晚期，Kif4A主要受Aurora B激酶磷酸化修飾，修飾發(fā)生在T799和S801位點，修飾后的Kif4A集中在紡錘體中央?yún)^(qū)（spindle midzone）和中小體（midbody）上，協(xié)助姐妹染色單體的分離和紡錘體中央?yún)^(qū)（midzone）及中小體（midbody）的形成。磷酸化的修飾使Kif4A具備了不同的功能，進(jìn)而調(diào)節(jié)有絲分裂的進(jìn)程。但是Kif4A的不同磷酸化之間的關(guān)系仍不清楚，明確驅(qū)動蛋白Kif4A磷酸化調(diào)節(jié)的相互關(guān)系，有助于了解磷酸化修飾對Kif4A ATP酶活性調(diào)節(jié)的機(jī)制，同時更深入的闡明細(xì)胞有絲分裂過程。

為了研究Kif4A不同修飾的相互關(guān)系，我們需要體外表達(dá)并純化天然構(gòu)象的Kif4A蛋白。我們擬構(gòu)建Kif4A的體外真核表達(dá)載體pFastBac-Kif4A，轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)，得到桿狀病毒基因組，通過轉(zhuǎn)染SF9昆蟲細(xì)胞得到桿狀病毒，并表達(dá)和純化Kif4A蛋白。由于桿狀病毒基因組較大，傳統(tǒng)的方法轉(zhuǎn)染效率較低，無法得到高滴度的桿狀病毒，本研究通過對轉(zhuǎn)染過程的優(yōu)化，得到了滴度更高，蛋白表達(dá)水平更高的桿狀病毒，為體外轉(zhuǎn)染SF9細(xì)胞提供了新的方法，同時為進(jìn)一步研究Kif4A在有絲分裂過程中的功能奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株

pFastBacHTb真核表達(dá)載體、pEGFPC1真核表達(dá)載體、pEGFP-kif4A真核表達(dá)載體為本實驗室自存；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans T1購自北京全式金生物技術(shù)有限公司、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH10Bac購自上海唯地生物技術(shù)有限公司；草地夜蛾卵巢細(xì)胞SF9為本實驗室保存細(xì)胞株。

1.1.2 主要試劑與儀器

2×Taq Master Mix（南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司）；限制性內(nèi)切酶SalⅠ、BamHⅠ、BglⅡ以及Superfect轉(zhuǎn)染試劑（美國QIAGEN公司）；T4DNA連接酶、Super DNA Marker（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）；凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）；特異性多克隆兔抗Kif4A抗體，實驗室自制；特異性單克隆鼠抗Flag抗體，美國Sigma公司；細(xì)胞培養(yǎng)及SIM SF（北京義翹神州科技有限公司）；其他化學(xué)試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。DNA序列測定和引物合成均由北京中美泰和生物技術(shù)有限公司完成。

Mycycler普通PCR儀（北京匯力宏業(yè)生物技術(shù)有限公司）、Nikon TS100倒置顯微鏡（日本Nikon公司）、BG-Power600通用電泳儀（北京百晶生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 pFastBac- Kif4A載體的構(gòu)建

將連接到pEGFPC1質(zhì)粒上的kif4A切下，連接到pFastBacHTb質(zhì)粒上。pFastBacHTb質(zhì)粒通過BamHⅠ和SalⅠ雙酶切；pEGFPC1-kif4A質(zhì)粒通過SalⅠ和BglⅡ雙酶切；酶切產(chǎn)物經(jīng)過凝膠回收試劑盒回收，按照適當(dāng)?shù)谋壤肨4 DNA連接酶室溫連接1h，將所得全部連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans T1感受態(tài)細(xì)胞，涂布在LB-AMP+（含氨芐青霉素）抗性固體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，篩選陽性克隆，利用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切鑒定。將初步鑒定正確的質(zhì)粒送北京中美泰和生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.2 轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞

將所得到的正確的pFastBac- Kif4A質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中，細(xì)胞復(fù)蘇4h后，涂布到含有Tet+、Kan+、Gen+（含四環(huán)素、卡那霉素、慶大霉素）3種抗性的LB固體培養(yǎng)基上。37℃避光培養(yǎng)48h。由于pFastBacHTb質(zhì)粒在DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中會發(fā)生轉(zhuǎn)座，轉(zhuǎn)座的發(fā)生破壞了細(xì)胞中的Lac Z的基因，使細(xì)胞不能分解X-gal而形成白色的克隆。經(jīng)過藍(lán)白斑篩選，挑取3個白色克隆，在新的固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)16～24h，進(jìn)一步驗證白色克隆確實發(fā)生了轉(zhuǎn)座。

1.2.3 桿狀病毒基因組的提取及驗證

挑取經(jīng)驗證發(fā)生轉(zhuǎn)座的克隆至含有Tet+、Kan+、Gen+（含四環(huán)素、卡那霉素、慶大霉素）三種抗性的LB液體培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)，提取桿狀病毒基因組。將菌液轉(zhuǎn)移到1.5mL離心管中，14000g離心1min；吸棄上清，0.3mL溶液I[15mmol/L Tris-HCl（pH8.0），10mmol/L EDTA，100μg/mL RNase A]重懸菌體，加0.3mL溶液II（0.2 mol/L NaOH， 1% SDS），顛倒混勻后室溫孵育5min；加入0.3mL 3mol/L醋酸鉀，顛倒混勻后冰上孵育5min；14000g室溫離心10min；將上清轉(zhuǎn)移到新的裝有0.8mL異丙醇的1.5mL離心管中，混合均勻后冰上孵育5min；14000g室溫離心15min；吸棄上清，加入0.5mL 70%的乙醇，14000g室溫離心5min；吸棄上清，室溫干燥5min，50μL超純水溶解沉淀DNA。用所得桿狀病毒基因組進(jìn)行PCR驗證轉(zhuǎn)座的發(fā)生，引物序列：M13-Fwd 5'-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3'；Kif4A-antisense 5' GCACTGATTACATTTCCC 3'。

1.2.4 SF9細(xì)胞培養(yǎng)與SF9細(xì)胞轉(zhuǎn)染

SF9細(xì)胞用SIM SF培養(yǎng)基，27℃下，120r/min懸浮培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前，將SF9細(xì)胞接種于6孔板，每孔2mL SIM SF培養(yǎng)基中接種1×106個細(xì)胞，27℃下細(xì)胞貼壁1h后進(jìn)行桿狀病毒基因組轉(zhuǎn)染。1μg重組桿狀病毒DNA稀釋到150μL SIM SF培養(yǎng)基中，15μL Superfect轉(zhuǎn)染試劑稀釋到150μL SIM SF培養(yǎng)基中，將基因組與轉(zhuǎn)染試劑混合均勻后，室溫孵育20min。標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)染方法：20min后，去除舊的培養(yǎng)基，加入1.7mL新培養(yǎng)基，滴入轉(zhuǎn)染混合液，轉(zhuǎn)染5h后換液，去除轉(zhuǎn)染混合液，加入2mL含環(huán)丙沙星抗生素的SIM SF培養(yǎng)基，27℃培養(yǎng)4d。優(yōu)化的轉(zhuǎn)染方法：20min后，去除舊的培養(yǎng)基，加入0.7mL新培養(yǎng)基，滴入轉(zhuǎn)染混合液，轉(zhuǎn)染5h后，加入1mL含兩倍環(huán)丙沙星抗生素的SIM SF培養(yǎng)基，27℃培養(yǎng)4d。4d后得到的細(xì)胞培養(yǎng)基，500g離心5min，收集桿狀病毒，4℃保存。

1.2.5 桿狀病毒滴度的鑒定

24孔板中接種5×104個細(xì)胞，細(xì)胞貼壁1h后，按照設(shè)置好的濃度梯度，1：1、1：10、1：50、1：200、1：500、1：1000分別加入桿狀病毒，細(xì)胞培養(yǎng)72h，收取細(xì)胞，100μL 1×的loading buffer（SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，甘油體積分?jǐn)?shù)為10%，Tris-Cl濃度為50mmol/L，pH為6.8，β-巰基乙醇體積分?jǐn)?shù)為1%，溴酚藍(lán)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.004%）裂解，Western Blot檢測蛋白水平。

1.2.6 Western Blot 檢測蛋白表達(dá)

取20μL裂解液進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，恒定電流為30mA，分離蛋白質(zhì)1.5h后，半干轉(zhuǎn)印電泳槽轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至PVDF膜上，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50mg/mL的脫脂奶粉封閉30min后，以鼠抗Flag標(biāo)簽為一抗室溫孵育2h，以偶聯(lián)了辣根過氧化物酶的羊抗鼠抗體為二抗室溫孵育1h，將增強化學(xué)發(fā)光劑（ECL）與H2O2混合后，與PVDF膜孵育3min，暗室內(nèi)用X射線膠片進(jìn)行顯影。

1.2.7 桿狀病毒的擴(kuò)增

6cm平皿中接種3×106個細(xì)胞，細(xì)胞貼壁1h后，加入20μL的桿狀病毒，培養(yǎng)72h后，收取細(xì)胞培養(yǎng)液，500g離心5min，將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，4℃保存。

2 結(jié)果

2.1 pFastBac- Kif4A載體的構(gòu)建

將用SalⅠ和BglⅡ雙酶切的pEGFP-Kif4A質(zhì)粒和用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切的pFastBacHTb質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，如圖1（A）所示。之后通過割膠回收得到Kif4A和pFastBacHTb線性DNA，如圖1（B）所示。通過T4連接酶室溫連接1h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans T1感受態(tài)，挑取陽性克隆，如圖1（C）。通過質(zhì)粒提取試劑盒提取pFastBac-Kif4A質(zhì)粒。質(zhì)粒經(jīng)過測序，與NCBI公布的序列比對，DNA序列信息相同，證明pFastBac- Kif4A質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 pFastBac-Kif4A質(zhì)粒在DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)座與驗證

將構(gòu)建好的pFastBac-Kif4A質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中，48h后觀察培養(yǎng)基上藍(lán)白斑克隆的狀況，挑取3個待鑒定的白色克隆劃線到新的培養(yǎng)基上，24h后觀察菌落顏色，如圖2（A）所示，經(jīng)鑒定菌落顏色確實為白色。挑取白色克隆，過夜培養(yǎng)，提取桿狀病毒基因組，通過PCR的方法驗證轉(zhuǎn)座的發(fā)生，如圖2（B）所示，PCR產(chǎn)物電泳圖可以看到明顯的條帶，且大小與理論值相符，證明轉(zhuǎn)座成功。

2.3 桿狀病毒基因組轉(zhuǎn)染SF9細(xì)胞

應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的和優(yōu)化的轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行SF9細(xì)胞轉(zhuǎn)染，顯微鏡下對細(xì)胞進(jìn)行觀察?？梢园l(fā)現(xiàn)，對照組細(xì)胞是未經(jīng)過任何處理的，細(xì)胞形態(tài)和大小正常，大多數(shù)細(xì)胞貼壁；標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)染方法中，只有小部分細(xì)胞變圓、變大，并且貼壁不牢（圖3黑框所示）；而優(yōu)化的轉(zhuǎn)染方法中，大部分細(xì)胞變圓、變大，貼壁效果明顯降低，如圖3所示。