梁振普,陳陽光,杜俊陽,曹瀚文,張小霞,代金平,楊新平,蘇萍

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河南 鄭州 450002;2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所,新疆 烏魯木齊 830091;3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十四師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所, 新疆 昆玉 848116)

眾所周知,害蟲對(duì)農(nóng)作物的破壞會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。在害蟲的應(yīng)急防控中,化學(xué)殺蟲劑的使用仍然是傳統(tǒng)的技術(shù)手段。由于化學(xué)殺蟲劑的廣泛使用,不僅造成了環(huán)境污染,同時(shí)隨著同類殺蟲劑的反復(fù)使用,不可避免地造成了目標(biāo)害蟲抗藥性增加等諸多生態(tài)學(xué)問題[2-3]。相對(duì)于化學(xué)防治,生物防治是一種對(duì)環(huán)境友好的防治策略。生物殺蟲劑(如桿狀病毒殺蟲劑)因其具有特異性高、易于生物降解、對(duì)哺乳動(dòng)物和環(huán)境都安全等諸多優(yōu)點(diǎn),在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)綠色防控中也逐漸受到重視[4-5]。但是野生型桿狀病毒殺蟲劑具殺蟲譜窄、殺蟲速度較慢等缺陷,這在很大程度上妨礙了其推廣應(yīng)用。針對(duì)野生型桿狀病毒在應(yīng)用中的不足之處,人們通過基因工程技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分子改良,有望改進(jìn)這些缺點(diǎn),從而增加這類殺蟲劑的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。

本文綜述了桿狀病毒和其作為殺蟲劑方面的應(yīng)用、桿狀病毒殺蟲劑的生產(chǎn)工藝及在遺傳改良方面取得的進(jìn)展,同時(shí)對(duì)昆蟲桿狀病毒殺蟲劑的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

1 桿狀病毒的概述

桿狀病毒屬于桿狀病毒科(Baculoviridae),其特點(diǎn)是有包涵體(occlusion body,OB),鑒于其OB的形態(tài)特征可分為兩個(gè)屬,即核型多角體病毒屬(Nucleopolyhedrovirus,NPV)和顆粒體病毒屬(Ganulovirus,GV),其中NPV的包涵體呈現(xiàn)不規(guī)則多角體形狀,GV的包涵體呈圓形或卵圓形[6]。桿狀病毒是一類對(duì)節(jié)肢動(dòng)物具有感染性的病毒,具有很高的宿主特異性。桿狀病毒在其生命周期中會(huì)產(chǎn)生兩種形式的病毒粒子,即包埋型病毒粒子(occlusion-derived virion,ODV)和芽生型病毒粒子(budded virion,BV)[6]。這兩種病毒粒子的核衣殼結(jié)構(gòu)相同,但囊膜來源不同,BV的囊膜來源于細(xì)胞膜,而ODV的囊膜來源于核膜,這導(dǎo)致了兩種病毒粒子在侵染過程中發(fā)揮不同的作用。其中,BV負(fù)責(zé)在細(xì)胞間進(jìn)行傳播,而ODV在經(jīng)口感染宿主的過程中發(fā)揮著重要作用[7]。包涵體是ODV被多角體蛋白包裹形成的穩(wěn)定結(jié)構(gòu),可以幫助桿狀病毒抵抗外界環(huán)境的降解,在桿狀病毒的應(yīng)用方面具有不可替代的作用。

2 昆蟲桿狀病毒載體表達(dá)系統(tǒng)及其應(yīng)用

昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng) (baculovirus expression vector system,BEVS) 是一種在昆蟲細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行蛋白表達(dá)的表達(dá)系統(tǒng),現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于外源蛋白表達(dá)、病毒樣顆粒表制備、桿狀病毒表面展示系統(tǒng)等領(lǐng)域。在當(dāng)今基因工程領(lǐng)域四大表達(dá)系統(tǒng)中,由于BEVS可以同時(shí)表達(dá)多個(gè)蛋白并且可以對(duì)蛋白進(jìn)行翻譯后修飾,使其成為應(yīng)用廣泛的真核表達(dá)系統(tǒng)[8]。

利用桿狀病毒表達(dá)外源蛋白,需要制備具有感染性的重組病毒,而最初構(gòu)建重組桿狀病毒是用同源重組的方法,此方法制備重組桿狀病毒需要經(jīng)過多輪空斑篩選,其過程費(fèi)時(shí)費(fèi)力,同時(shí),也極易得到假陽性重組病毒。為了解決以上問題,LUCKOW等[9]將細(xì)菌的mini-F復(fù)制子整合到桿狀病毒基因組,構(gòu)建一種既能在大腸桿菌中復(fù)制,也能感染昆蟲細(xì)胞的新型桿狀病毒穿梭載體(bacmid)。圖1是重組桿狀病毒構(gòu)建示意圖。具體過程如下:首先,將目標(biāo)基因插入到供體(donor)質(zhì)粒,獲得重組donor質(zhì)粒。然后,將重組donor質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH10Bac細(xì)胞,在輔助(helper)質(zhì)粒編碼的轉(zhuǎn)座酶幫助下,將位于重組donor質(zhì)粒Tn7R-Tn7L間的外源基因特異性地轉(zhuǎn)座到bacmid上,通過藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定可獲得重組bacmid。

圖1 重組桿狀病毒構(gòu)建示意圖Figure 1 Schematic diagram of recombinant baculovirus construction

2.1 外源蛋白表達(dá)

通過對(duì)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的不斷優(yōu)化,使得外源基因插入到桿狀病毒表達(dá)載體中的成功率有所提高,所以有越來越多的外源基因可以通過該系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)。該系統(tǒng)進(jìn)行外源蛋白表達(dá)有以下優(yōu)點(diǎn):1)可以對(duì)外源蛋白進(jìn)行翻譯后修飾;2)BEVS具有強(qiáng)啟動(dòng)子,如強(qiáng)多角體蛋白啟動(dòng)子或P10強(qiáng)啟動(dòng)子,可以高水平表達(dá)外源蛋白;3)可以同時(shí)表達(dá)多個(gè)外源蛋白。該系統(tǒng)表達(dá)的外源蛋白有以下應(yīng)用:1)BEVS產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可用藥物篩選、外源蛋白結(jié)構(gòu)和功能分析、生產(chǎn)蛋白質(zhì)治療藥物[10-11];2)表達(dá)多種蛋白質(zhì),包括糖蛋白、酶、重組病毒、酶和疫苗。

2.2 昆蟲桿狀病毒表達(dá)病毒樣顆粒

病毒樣顆粒(virus-like particle, VLP)是由一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源結(jié)構(gòu)蛋白組裝形成的結(jié)構(gòu)化蛋白顆粒,缺乏病毒遺傳物質(zhì),因此不具有傳染性[12];根據(jù)親本病毒的結(jié)構(gòu),VLP存在有無包膜之分。構(gòu)建的VLP在形態(tài)結(jié)構(gòu)上與天然的病毒顆粒相似,因此可以高效地誘發(fā)體液與細(xì)胞免疫,具有很強(qiáng)的生物學(xué)活性,這被認(rèn)為是一種安全的候選疫苗[13-14],是一種可以展示真實(shí)構(gòu)象的病毒抗原。

目前,VLP的生產(chǎn)常利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)[15]。人乳頭瘤病毒、流感病毒[16]、丙型肝炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒等病毒都在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)中成功表達(dá)出了病毒樣顆粒[17]。VLP還可借助先進(jìn)的材料進(jìn)一步得到廣泛應(yīng)用。目前,VLP被用作納米機(jī)器[18],將藥物活性產(chǎn)品輸送到人體內(nèi)的特定細(xì)胞的特定部位。在全球流行的COVID-19方面,VLP生產(chǎn)的COVID-19疫苗同樣具有優(yōu)勢(shì),可以通過BEVS合成新冠病毒蛋白,形成VLP[11]。

2.3 桿狀病毒表面展示系統(tǒng)及其應(yīng)用

桿狀病毒展示技術(shù)(baculovirus surface display,BSD)是一種在桿狀病毒表面展示外源性多肽和蛋白質(zhì)的新方法。它是創(chuàng)建和展示表位特異性抗體結(jié)合位或任何其他感興趣的肽或蛋白質(zhì)的有效方法,可用于抗體、疫苗和生物藥物的研發(fā)[19-20]。在桿狀病毒上展示感興趣的蛋白質(zhì),通常是在衣殼或病毒囊膜上進(jìn)行展示[21]。一種展示策略是在AcMNPV上進(jìn)行了外源蛋白的插入,在主要的囊膜蛋白GP64上進(jìn)行了融合或者將外源蛋白融合到GP64的氨基末端[22-23]。另一種展示策略是與桿狀病毒的衣殼蛋白融合,例如AcMNPV最豐富的核衣殼蛋白VP39。在VP39的氨基或羧基末端融合導(dǎo)致成功展示感興趣的蛋白質(zhì)[19]。

3 昆蟲桿狀病毒在殺蟲劑中的研究及應(yīng)用

3.1 昆蟲桿狀病毒殺蟲劑的優(yōu)缺點(diǎn)

昆蟲病原病毒是微生物源殺蟲劑的重要種類,大多數(shù)研究集中在桿狀病毒上。桿狀病毒作為殺蟲劑有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn):1)在眾多昆蟲病毒中,桿狀病毒被認(rèn)為是安全且有選擇性的生物殺蟲劑,僅限于無脊椎動(dòng)物,它們?cè)谑澜绶秶鷥?nèi)被廣泛用于防治以鱗翅目為主的多種害蟲[24],也對(duì)非目標(biāo)生物無害,包括有益的捕食者、脊椎動(dòng)物和植物[25-26];2)桿狀病毒可在昆蟲種群中引起流行,并在環(huán)境中長(zhǎng)期有效[27];3)昆蟲對(duì)許多化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生抗性,但桿狀病毒殺蟲劑對(duì)昆蟲的使用很少產(chǎn)生抗性[24];4)桿狀病毒可以與其他害蟲防治方法一起使用,提高殺蟲效率。

缺點(diǎn):1)由于桿狀病毒具有較高的特異性,使其宿主范圍變窄,限制了應(yīng)用范圍[28];2)殺死目標(biāo)害蟲的速度相對(duì)較慢,某些桿狀病毒,如核型多角體病毒,通常需要3～7 d時(shí)間才能殺死宿主[29];3)昆蟲病毒不易長(zhǎng)期儲(chǔ)存,生產(chǎn)成本相對(duì)于傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥高[29-30]。

3.2 昆蟲桿狀病毒殺蟲劑的應(yīng)用

3.2.1 獨(dú)立使用 桿狀病毒殺蟲劑在許多國(guó)家被用于鱗翅目、膜翅目和鞘翅目的防治,其中在控制鱗翅目害蟲中應(yīng)用最為廣泛[31-32]。目前,世界各地已經(jīng)開發(fā)了使用昆蟲桿狀病毒殺蟲劑的項(xiàng)目,許多桿狀病毒殺蟲劑已經(jīng)在阿根廷、澳大利亞、加拿大、哥倫比亞、德國(guó)、印度、日本、秘魯、南非和美國(guó)等國(guó)家注冊(cè)[29,33-36]。中國(guó)昆蟲病毒的研究始于20世紀(jì)50年代中期家蠶核型多角體病毒,而將昆蟲病毒作為生物防治劑的使用始于20世紀(jì)60年代初[37]。迄今為止,中國(guó)已使用超過32種昆蟲病毒來控制農(nóng)業(yè)、林業(yè)、牧場(chǎng)和花園中的害蟲。截至2023年,12種病毒被中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準(zhǔn)為商品病毒殺蟲劑,其中10種屬于桿狀病毒科(http://www.chinapesticide.org.cn/hysj/index.jhtml)。

3.2.2 復(fù)配使用 由于桿狀病毒單獨(dú)用于防治害蟲會(huì)導(dǎo)致以下兩個(gè)問題:一是殺蟲速度緩慢,導(dǎo)致農(nóng)作物受損嚴(yán)重;二是病毒的宿主特異性強(qiáng),導(dǎo)致只作用一種害蟲。在應(yīng)用上,經(jīng)常把桿狀病毒與其他成分進(jìn)行復(fù)配使用,根據(jù)復(fù)合劑復(fù)合成分的不同,可把昆蟲病毒復(fù)合殺蟲劑概括為兩大類型:一種類型是低毒化學(xué)農(nóng)藥與病毒復(fù)配的殺蟲劑,該殺蟲劑可顯著提高殺蟲效率,同時(shí)也減少了化學(xué)農(nóng)藥的用量;第二種類型是微生物與病毒復(fù)合的殺蟲劑,該殺蟲劑具有廣譜性、速效性和特異性[38]。昆蟲病毒與微生物復(fù)合生物殺蟲劑既具有良好從殺蟲效果,又能克服重組病毒生產(chǎn)上的困難,易于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。例如,20世紀(jì)80年代美國(guó)亞利桑那大學(xué)西棉研究室采用AcNPV與Bt復(fù)配劑防治棉花煙芽夜蛾,近年來我國(guó)采用小菜蛾顆粒體病毒-Bt復(fù)合生物殺蟲劑防治小菜蛾都取得了令人十分滿意的防治效果[39]。

3.3 昆蟲桿狀病毒的遺傳改造

實(shí)踐表明,與化學(xué)殺蟲劑相比,桿狀病毒殺蟲劑具有高度專一性、不殺傷天敵、對(duì)哺乳動(dòng)物和環(huán)境安全等優(yōu)點(diǎn)[6]。但是,野生型昆蟲桿狀病毒具有殺蟲速度慢、穩(wěn)定性差和宿主域窄等缺點(diǎn),因此學(xué)者們開始利用基因工程和分子生物學(xué)等手段來改造昆蟲病毒基因組,以創(chuàng)制高效、穩(wěn)定、防治面較廣的昆蟲桿狀病毒殺蟲劑[40-41]。

3.3.1 將外源基因插入桿狀病毒基因組 可以利用基因工程技術(shù),將外源基因插入到桿狀病毒基因組中構(gòu)建重組病毒,以提高殺蟲效率[42]。這些外源基因大致有2種類型:一類是昆蟲激素,它們參與調(diào)節(jié)宿主昆蟲發(fā)育、行為和生理狀態(tài)。在桿狀病毒感染期間,它們的過度表達(dá)會(huì)改變昆蟲宿主的發(fā)育、行為或穩(wěn)態(tài),進(jìn)而導(dǎo)致幼蟲宿主更快地死于病毒感染或更快地停止進(jìn)食[43]。目前普遍常用的昆蟲激素有利尿激素、羽化激素、促前胸腺激素和保幼激素酯酶[44-47]。另一類外源基因是來自各種有毒動(dòng)物的神經(jīng)毒素,包括草螨毒素tox34.4,蝎神經(jīng)毒素AaIT和LqhIT2,蜘蛛毒素μ-Aga-Ⅳ、Cit1a和Ar1b,以及海葵毒素As Ⅱ和Sh Ⅰ,這些毒素可作用于害蟲引起害蟲麻痹,停止進(jìn)食進(jìn)而加速死亡[2]。重組桿狀病毒殺蟲效率因啟動(dòng)子、外源基因、宿主昆蟲、病毒劑量和侵染方法的不同而產(chǎn)生不同的殺蟲效果[48]。

3.3.2 缺失桿狀病毒的非必需基因的殺蟲劑 由于桿狀病毒基因組中存在一些對(duì)病毒自身復(fù)制、增殖非必需的基因。因此,可缺失和修飾非必需基因,進(jìn)而提高桿狀病毒的殺蟲效率[49]。目前,人們已經(jīng)構(gòu)建出缺失egt、p10和p74基因的重組桿狀病毒[47,50-51]。最成功的例子是egt的缺失能夠顯著增強(qiáng)桿狀病毒的致病性,進(jìn)而提高殺蟲效率。egt編碼蛻皮甾體脲苷二磷酸葡糖轉(zhuǎn)移酶(ecdysteroid UDP-glucosyltransferase,EGT),是桿狀病毒非必需的早期基因, 同時(shí)也是昆蟲病毒中迄今為止已知的唯一在個(gè)體水平調(diào)控感染宿主的基因[52]。EGT酶通過催化糖分子與蛻皮甾體激素結(jié)合,阻止蛻皮甾體進(jìn)入細(xì)胞并有效地滅活蛻皮甾體激素,從而阻止幼蟲蛻皮,進(jìn)而導(dǎo)致幼蟲繼續(xù)取食、體重增加、病毒產(chǎn)量提高[47,52-53]。研究發(fā)現(xiàn)egt的缺失往往會(huì)加速宿主幼蟲的死亡,因此可以通過對(duì)egt的缺失來提高殺蟲效率[54]。

3.3.3 拓寬殺蟲譜的殺蟲劑 由于桿狀病毒通常具有較窄的殺蟲譜,了解它們控制宿主范圍的機(jī)制是改進(jìn)其作為殺蟲劑應(yīng)用的先決條件[28]。先前的研究報(bào)道了一些與宿主范圍相關(guān)的基因如p143、hrf-1、hcf-1、ie2、p35和iap,通過對(duì)這些基因的修飾或者缺失能夠使宿主的范圍變廣[55]。最近研究發(fā)現(xiàn)將缺乏p35的AcMNPV突變體(vAc Δp35)和SeMNPV的DNA片段共轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞,得到宿主范圍擴(kuò)大的重組病毒株(vAcRev)。在四種昆蟲細(xì)胞系和三種昆蟲幼蟲中驗(yàn)證了 vAcRev的宿主特異,發(fā)現(xiàn)其不僅能夠感染該病毒的親本宿主,而且能夠感染其他昆蟲宿主[34]。

3.3.4 影響昆蟲激素相關(guān)基因的表達(dá) RNA干擾(RNA interference,RNAi)是通過內(nèi)源或外源雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)引發(fā)mRNA降解,導(dǎo)致特異性基因沉默,在生物學(xué)研究中廣泛應(yīng)用并顯示出巨大的潛力[56-57]。在防治農(nóng)業(yè)害蟲和病原體方面,RNAi技術(shù)已成為研究基因功能的有力遺傳工具[58]。先前的研究發(fā)現(xiàn),JH酸性甲基轉(zhuǎn)移酶(JHAMT)是一種不可替代的酶,在保幼激素(JH)合成中尤為重要。JH結(jié)合蛋白基因(JHBP)可以保護(hù)化學(xué)不穩(wěn)定的JH免受非特異性酶降解,抑制兩個(gè)基因HaJHAMT和HaJHBP的表達(dá),以降低棉鈴蟲的JH濃度并進(jìn)一步影響幼蟲的存活[43,59-60]?；诖?LIU等[43]構(gòu)建了針對(duì)棉鈴蟲JHAMT和JHBP dsRNA的重組HearNPV,通過抑制這兩個(gè)基因的表達(dá)進(jìn)而提高桿狀病毒的殺蟲活性。

MicroRNAs(miRNAs)是一類小的非編碼RNA,能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控mRNA的表達(dá)具有重要的生物學(xué)功能[61-62]。在昆蟲中,miRNAs已經(jīng)被證明可以調(diào)節(jié)整個(gè)生命周期的各種生理過程,包括蛻皮、變態(tài)、卵發(fā)生、胚胎發(fā)生、行為和免疫[62-63]。miRNA在桿狀病毒感染和病毒宿主相互作用中也起著重要作用[64]。研究發(fā)現(xiàn)bantam是Sf9細(xì)胞中最豐富的miRNA之一。用bantam的抑制劑飼喂斜紋夜蛾和甜菜夜蛾的幼蟲,可以導(dǎo)致昆蟲幼蟲生長(zhǎng)異常、化蛹率降低、增加AcMNPV對(duì)昆蟲的傳染性、導(dǎo)致幼蟲加速死亡[65-66]。當(dāng)抑制bantam的水平時(shí),可以提高受感染昆蟲的蛻皮激素(20-羥基蛻皮激素)的水平,導(dǎo)致對(duì)桿狀病毒感染的易感性增加,使病毒具有更強(qiáng)的殺蟲活性和更短的致死時(shí)間[64]。

4 桿狀病毒殺蟲劑的生產(chǎn)

桿狀病毒和其他病毒一樣,只能在活細(xì)胞、活組織或有機(jī)體中生長(zhǎng)繁殖。用細(xì)胞培養(yǎng)來大規(guī)模生產(chǎn)昆蟲病毒,由于生產(chǎn)成本和生產(chǎn)過程中的技術(shù)問題,還沒有大規(guī)模應(yīng)用。目前為止,大多數(shù)商業(yè)化的桿狀病毒的生產(chǎn),還需要在宿主昆蟲中進(jìn)行。桿狀病毒殺蟲劑生產(chǎn)工藝一般分為工廠化生產(chǎn)和野外田間生產(chǎn)。

以棉鈴蟲桿狀病毒殺蟲劑為例,工廠化生產(chǎn)桿狀病毒殺蟲劑的步驟包括選留蟲種、成蟲交配產(chǎn)卵、幼蟲飼養(yǎng)、病毒感染增殖、病死蟲收集、制劑加工、產(chǎn)品檢測(cè)和分裝等。選擇健康的棉鈴蟲,在產(chǎn)卵箱內(nèi)進(jìn)行交配產(chǎn)卵,蟲卵落在產(chǎn)卵箱的紙帕上。將帶有蟲卵的紙帕進(jìn)行消毒,然后轉(zhuǎn)移到有人工飼料的養(yǎng)蟲盤上,最后放在飼養(yǎng)室。當(dāng)幼蟲發(fā)育到4齡,5%用來留種,95%用來生產(chǎn)病毒。感染后第6天開始收集病死幼蟲。將收集的病毒致死幼蟲,經(jīng)研磨,離心除雜,噴霧或者冷凍干燥,再加輔助劑混合,經(jīng)0.25 mm過篩,即成可濕性粉劑,檢驗(yàn)合格后稱量分裝[67]。

以茶蠶顆粒體病毒殺蟲劑為例,野外田間生產(chǎn)桿狀病毒殺蟲劑的步驟如下:選擇存在大量茶蠶的茶園、于茶蠶2～3齡期噴灑病毒、接毒后7～15 d即為感病死亡高峰期、病死蟲收集、制劑加工、產(chǎn)品檢測(cè)和分裝[68]。后面步驟基本同工廠化生產(chǎn)病毒殺蟲劑一致。

5 昆蟲桿狀病毒殺蟲劑的安全性

桿狀病毒作為生物農(nóng)藥具有若干優(yōu)勢(shì)。它們是自然產(chǎn)生的病原體,對(duì)昆蟲和密切相關(guān)的節(jié)肢動(dòng)物具有高度特異性。就對(duì)脊椎動(dòng)物(如哺乳動(dòng)物、鳥類、魚類、兩棲動(dòng)物、爬行動(dòng)物)的致病性而言,它們是安全的。此外,它們對(duì)自然抑制害蟲種群的有益生物的致病性是友好的[4-5]。雖然桿狀病毒在昆蟲種群的自然控制中起著重要作用,但從農(nóng)業(yè)工業(yè)的角度來看,天然桿狀病毒是不完美的殺蟲劑。許多作物只能承受最低程度的果實(shí)或葉面損害。天然桿狀病毒的自然殺傷速度為3～7 d以上。利用重組DNA技術(shù)修飾桿狀病毒,解決了殺傷速度慢的問題,然而其安全性需要重新評(píng)估[69]。在研究重組病毒是否影響動(dòng)物的試驗(yàn)中,肖化忠等[70]將重組病毒口服或水中投毒感染健康的動(dòng)物,并將感染后的動(dòng)物解剖,組織切片及電鏡觀察。結(jié)果表明:被重組病毒感染的動(dòng)物活動(dòng)正常臟器無病變且電鏡觀察并沒有病毒粒子存在。在研究重組病毒是否影響培養(yǎng)細(xì)胞的試驗(yàn)中,肖化忠等[70]將不同種類的細(xì)胞培養(yǎng)成單層,并使用不同梯度的BV去感染,最后不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行觀察,被重組病毒感染的細(xì)胞與對(duì)照組無明顯差別。盡管以上結(jié)果說明,重組病毒對(duì)動(dòng)物是安全的對(duì)人和動(dòng)物細(xì)胞不造成感染,但是重組病毒也不是絕對(duì)安全的,對(duì)其生物安全性還要進(jìn)行長(zhǎng)期、深入全面地分析和研究。

6 昆蟲桿狀病毒研究與應(yīng)用展望

隨著對(duì)桿狀病毒的研究越來越深入,對(duì)桿狀病毒的應(yīng)用也將越來越普遍。各種各樣的病毒和疾病等危害人類和其他哺乳動(dòng)物的生存,桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在疫苗研究、基因治療、藥物篩選、蛋白表達(dá)方面和生物殺蟲劑方面越來越重要。近3年來,在全球范圍爆發(fā)的新冠肺炎病毒,桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)被用來表達(dá)新冠病毒蛋白形成VLP,這進(jìn)一步揭示了在未來醫(yī)療方面,桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)將被應(yīng)用更加廣泛。在未來的基因治療領(lǐng)域,桿狀病毒可能針對(duì)某些癌癥、遺傳病、基因缺陷等疾病有不可低估的應(yīng)用前景。針對(duì)農(nóng)業(yè)害蟲防治,重組昆蟲桿狀病毒殺蟲劑的研究可從以下幾個(gè)方面考慮:一是尋找一些新的外源基因,充分利用基因工程技術(shù)對(duì)桿狀病毒進(jìn)行改造,提高殺蟲效率;二是解決重組昆蟲桿狀病毒殺蟲劑在生產(chǎn)中遇到的問題,降低生產(chǎn)成本;三是解決重組昆蟲桿狀病毒殺蟲劑在運(yùn)輸和保存中遇到的問題,保證高質(zhì)量重組昆蟲桿狀病毒殺蟲劑的供應(yīng);四是探索桿狀病毒在大田環(huán)境中應(yīng)用的穩(wěn)定性,從而為以后昆蟲桿狀病毒殺蟲劑的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用打下基礎(chǔ)。