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        14-3-3η蛋白的生物信息學(xué)分析及原核表達(dá)

        2018-03-24 01:40:31安冬潔魏調(diào)霞高春辰曹秀麗趙俊龍秦鴻雁
        中華老年多器官疾病雜志 2018年3期
        關(guān)鍵詞:融合

        安冬潔,魏調(diào)霞,高春辰,曹秀麗,趙俊龍,秦鴻雁

        (空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部遺傳學(xué)與發(fā)育生物學(xué)教研室,西安 710032)

        14-3-3蛋白是一類廣泛表達(dá)的酸性調(diào)控蛋白家族,其在哺乳動(dòng)物中存在7種亞型(β,ε,η,γ,τ,ζ和σ)[1],且不同亞型間氨基酸順序具有高度的一致性和保守性[2]。14-3-3蛋白通常以同源或異源二聚體和靶蛋白通過(guò)特定的磷酸化基序相互作用[3],通過(guò)改變靶蛋白細(xì)胞亞定位、 磷酸化狀態(tài)和活化狀態(tài)來(lái)參與許多重要的生命過(guò)程[2],包括轉(zhuǎn)錄翻譯、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白運(yùn)輸、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡等[4,5]。

        單核巨噬細(xì)胞分布在體內(nèi)各組織器官當(dāng)中,在天然免疫、系統(tǒng)代謝、血管生成、惡性腫瘤中具有重要的調(diào)控作用[6]。不同的微環(huán)境信號(hào)刺激下,巨噬細(xì)胞可以發(fā)生表型和功能的改變,分為經(jīng)典活化的M1型巨噬細(xì)胞和替代活化的M2型巨噬細(xì)胞。M1型巨噬細(xì)胞高表達(dá)腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-1等促炎因子,具有抗菌抗腫瘤的作用;M2型巨噬細(xì)胞則高表達(dá)精氨酸酶1(arginase 1)、類幾丁質(zhì)酶3樣分子3(chitinase 3-like 3,Ym1)、IL-10、甘露糖受體(Mrcl)等,具有抗炎促腫瘤和促進(jìn)組織修復(fù)的功能[7]。研究表明,14-3-3對(duì)巨噬細(xì)胞功能的活化和生存起著重要的作用,已報(bào)道的亞型主要有14-3-3ζ、14-3-3β和14-3-3ε。在炎性細(xì)胞因子干擾素-γ(interferon-γ,INF-γ)的刺激下,14-3-3ζ通過(guò)調(diào)節(jié)coronin 1蛋白亞細(xì)胞定位來(lái)調(diào)控巨噬細(xì)胞吞噬功能[8]。上皮性卵巢癌及阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)中相關(guān)巨噬細(xì)胞14-3-3ζ和14-3-3ε表達(dá)異常升高[9,10],提示14-3-3可能通過(guò)改變巨噬細(xì)胞的功能參與調(diào)控疾病的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)[11],14-3-3η亞型在脂肪組織巨噬細(xì)胞M2型極化中扮演重要角色,但是其具體分子機(jī)制尚不明確。

        本研究在探究不同極化類型巨噬細(xì)胞中14-3-3η mRNA表達(dá)水平差異的基礎(chǔ)上,對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析,構(gòu)建小鼠14-3-3η基因的原核表達(dá)載體后誘導(dǎo)表達(dá),得到含有谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase,GST)標(biāo)簽的14-3-3η蛋白,為今后研究14-3-3蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞功能的作用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        原核表達(dá)載體pGEX-4T-3、大腸桿菌DH5α和BL21菌株(空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部遺傳學(xué)與發(fā)育生物學(xué)教研室);胰化蛋白胨、酵母提取物和瓊脂粉(Oxoid公司);14-3-3抗體(Santa Cruz公司);辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG(博士德公司);rTaq酶、限制性內(nèi)切酶、連接酶、DNA marker、蛋白預(yù)染maker、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒(TaKaRa公司);HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qRT-PCR和ChamQTMSYBR@qPCR Master Mix(Vazyme公司);GST標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司);異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG;科昊生物)。

        1.2 方法

        1.2.1 RNA提取 野生型C57BL/6小鼠骨髓原代巨噬細(xì)胞中加入TRIzol,靜置5 min后加入氯仿震蕩離心,上清加入異丙醇沉淀RNA,用75%乙醇洗2遍RNA,干燥后加入RNase free ddH2O溶解,定量。

        1.2.2 qRT-PCR 每個(gè)樣品取1000 ng RNA反轉(zhuǎn)錄,總體系20 μl,4 μl反轉(zhuǎn)錄Mix,剩余體積用RNaes free ddH2O補(bǔ)平。反應(yīng)條件為37℃ 30 min,85℃ 15 s。以其作模板進(jìn)行qRT-RCR(ABI 7500),反應(yīng)條件:95℃ 30 s,96℃ 5 s,60℃ 34 s,β-actin作為內(nèi)參基因,其中14-3-3η上游引物序列為5’-ACCATGGCAGATGGGAATGAG-3’,下游引物序列為5’-GGTAGCGGTAGTAATCGCCC-3’;β-actin上游引物序列為5’-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3’,下游引物序列為5’-ATGGAGCCACCGATCCACA-3’。

        1.2.3 pGEX-4T-3-14-3-3η的構(gòu)建 根據(jù)小鼠14-3-3η基因編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物,上下游引物分別加入EcoRⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn),上游引物:5’-CGGAATTCAATGGGGGATCGAGAGCAGCT-3’,下游引物:5’-GCGTCGACTCAGTTGCCTTCTCCTGCTTCTT-3’;以小鼠原代巨噬細(xì)胞cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增,PCR反應(yīng)條件:95℃ 5 min,95℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 1 min,共35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。擴(kuò)增好的14-3-3η基因進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,膠回收PCR產(chǎn)物后用EcoRⅠ和SalⅠ 雙酶切,連接pGEX-4T-3載體。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α,37℃培養(yǎng)過(guò)夜挑取單克隆,37℃搖菌16 h,提取質(zhì)粒,進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序。

        1.2.4 原核表達(dá)載體pGEX-4T-3-14-3-3η的小量誘導(dǎo)表達(dá) 測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中,挑取單克隆37℃搖菌過(guò)夜,次日以1∶100的比例轉(zhuǎn)接到4 ml LB培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)到菌液A600 nm達(dá)到0.6~1.0時(shí)加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá),37℃ 5 h。 收集菌液,經(jīng)SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色法檢測(cè)。

        1.2.5 GST-14-3-3η 蛋白的純化 按照1∶100的比例接種菌液到100 ml培養(yǎng)液中,37℃常規(guī)培養(yǎng)至菌液A600 nm值達(dá)到0.6~1.0,加入IPTG至終濃度為0.2 mmol/L,37℃誘導(dǎo)表達(dá)5 h。收集菌液至離心管中,離心收集沉淀。加入裂解緩沖液重懸菌體,冰上超聲裂解,收集上清,加入GST-tag Purification Resin,4℃孵育60 min,將混合物裝入親和層析空柱管中,洗柱5次后洗脫目的蛋白,二辛可寧酸(bicinchoninic acid,BCA)法對(duì)純化蛋白進(jìn)行定量后,用SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色進(jìn)行鑒定。

        1.2.6 融合蛋白Western blotting分析 取15 μg融合蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳,恒流170 mA轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)2 h,脫脂牛奶封閉2 h,一抗為兔源14-3-3抗體,4℃孵育過(guò)夜,二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體,37℃孵育1 h后,使用3,3-二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)發(fā)光顯色,觀察目的條帶。

        1.2.7 14-3-3η蛋白的生物信息學(xué)分析 蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè):ProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/);二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè):SOPMA (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html);疏水性分析由ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)軟件完成。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        2 結(jié) 果

        2.1 qRT-PCR檢測(cè)14-3-3η在原代巨噬細(xì)胞不同極化狀態(tài)下mRNA表達(dá)水平

        培養(yǎng)野生型C57BL/6小鼠骨髓原代巨噬細(xì)胞,

        脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)和INF-γ誘導(dǎo)M1型極化,IL-4誘導(dǎo)M2型極化。提取RNA,反轉(zhuǎn)錄后用qRT-PCR檢測(cè)14-3-3η表達(dá)水平。結(jié)果表明:14-3-3η在M1型巨噬細(xì)胞中表達(dá)量降低,在M2型巨噬細(xì)胞中表達(dá)量升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05;圖1),提示14-3-3η可能對(duì)巨噬細(xì)胞極化起作用。

        圖1 14-3-3η mRNA的表達(dá)

        Compared with control,*P<0.05,**P<0.01; compared with M1,##P<0.01

        2.2 14-3-3η蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

        采用SOPMA對(duì)14-3-3η蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果以α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主,α-螺旋占62.60%,無(wú)規(guī)則卷曲占29.27%,另外有11.38%的延伸鏈和5.69%的β轉(zhuǎn)角,其中α-螺旋對(duì)蛋白質(zhì)骨架具有穩(wěn)定作用,無(wú)規(guī)則卷曲決定了蛋白質(zhì)的功能,表明14-3-3η蛋白結(jié)構(gòu)具有較高的穩(wěn)定性(圖2)。

        2.3 14-3-3η蛋白理化性質(zhì)分析

        使用ProtParam tool分析14-3-3η蛋白序列,分子量為28.2 ku,理論等電點(diǎn)為4.81,其中酸性氨基酸總數(shù)(天冬氨酸+谷氨酸)為45個(gè),堿性氨基酸總數(shù)(精氨酸+賴氨酸)為32個(gè)。用ProtScale程序?qū)?4-3-3η蛋白進(jìn)行疏水性分析,縱坐標(biāo)0之上為疏水區(qū),0之下為親水區(qū),可知14-3-3η第100位氨基酸的疏水系數(shù)最高(1.900);第237位氨基酸的疏水系數(shù)最低(-2.600)。疏水性氨基酸在肽鏈中均勻分布,14-3-3η蛋白的疏水系數(shù)為-0.607,疏水性較差。一般疏水性較強(qiáng)的分子原核表達(dá)時(shí)易形成包涵體,此時(shí)需采用促進(jìn)目的蛋白可溶性表達(dá)菌株,而14-3-3η疏水性較差,因此我們采用GST可溶標(biāo)簽載體構(gòu)建14-3-3η原核表達(dá)載體,并選用大腸桿菌BL21菌株進(jìn)行原核表達(dá)。

        圖2 14-3-3η蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

        圖3 14-3-3蛋白的疏水性分析

        2.4 14-3-3η基因的擴(kuò)增

        以小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞cDNA為模板擴(kuò)增目的序列,特異性擴(kuò)增出14-3-3η(744 bp),與預(yù)期片段大小一致(圖4)。

        圖4 目的基因14-3-3η的PCR擴(kuò)增

        2.5 重組質(zhì)粒pGEX-4T-3-14-3-3η的構(gòu)建及鑒定

        將擴(kuò)增出的目的片段與pGEX-4T-3空載體經(jīng)EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切后連接,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌后挑取單克隆搖菌,提取質(zhì)粒。pGEX-4T-3-14-3-3η質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和SalⅠ 雙酶切后,可見(jiàn)744 bp條帶,符合目的片段大小(圖5)。測(cè)序結(jié)果經(jīng)比對(duì)后同14-3-3η序列一致,提示重組質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖6)。

        圖5 重組載體pGEX-4T-3-14-3-3η雙酶切鑒定結(jié)果

        2.6 重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-3-14-3-3η的誘導(dǎo)表達(dá)

        將pGEX-4T-3-14-3-3η重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21菌株中,37℃過(guò)夜培養(yǎng)后挑取單克隆活化菌液。首先摸索誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)最佳IPTG濃度,當(dāng)菌液A600 nm值達(dá)到0.6時(shí)加入不同終濃度IPTG誘導(dǎo)融合蛋白GST-14-3-3η的表達(dá),融合蛋白預(yù)期大小約55 ku。選取最佳IPTG濃度,再用不同溫度和不同時(shí)間誘導(dǎo)融合蛋白GST-14-3-3η的表達(dá),使融合蛋白盡量表達(dá)在細(xì)菌裂解液上清液里,收集菌液,裂解后經(jīng)SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色法檢測(cè),結(jié)果表明可溶性融合蛋白最佳表達(dá)條件為IPTG濃度0.1 mmol/L,25℃誘導(dǎo)表達(dá)16 h(圖7)。

        2.7 可溶性融合蛋白GST-14-3-3η的純化

        IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液經(jīng)超聲裂解,離心后收集上清,按照GST標(biāo)簽蛋白純化試劑盒操作步驟對(duì)融合蛋白GST-14-3-3η進(jìn)行純化。純化蛋白用BCA法進(jìn)行蛋白定量,蛋白濃度為6 mg/ml,行SDS-PAGE電泳,考馬斯亮藍(lán)染色和Western blotting(使用14-3-3抗體)鑒定結(jié)果顯示GST-14-3-3η融合蛋白得到了較高效的純化(圖8)。

        3 討 論

        組織定居巨噬細(xì)胞在組織穩(wěn)態(tài)維持、疾病損傷修復(fù)方面起著關(guān)鍵的作用[12,13]。在不同的細(xì)胞因子刺激下,巨噬細(xì)胞可以發(fā)生表型和功能的轉(zhuǎn)變,其中M1型巨噬細(xì)胞由Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)配體蛋白、INF-γ活化,M2型巨噬細(xì)胞由IL-4、IL-13、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)等誘導(dǎo)活化,分別調(diào)控TH1和TH2型免疫應(yīng)答[7]。巨噬細(xì)胞的極化則依賴于體內(nèi)多種信號(hào)通路及信號(hào)分子在轉(zhuǎn)錄水平或翻譯后水平的調(diào)控[14]。

        圖6 pGEX-4T-3-14-3-3η部分測(cè)序結(jié)果

        圖7 GST和GST-14-3-3η融合蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

        A: lysis of whole bacteria solution (1: empty vector; 2: empty vector induced by 0.5 mmol/L IPTG; 3: GST-14-3-3η; 4-8: GST-14-3-3η induced by 0.1, 0.2, 0.5, 0.8, 1.0 mmol/L IPTG respectively); B: supernatant of bacteria lysis (1-5: expression induction under the condition of 16℃ 16 h, 20℃ 16 h, 25℃ 16 h, 30℃ 16 h, 37℃ 5 h respectively). M: protein marker; GST: glutathione S-transferase; IPTG: isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

        圖8 GST-14-3-3η蛋白的純化

        14-3-3蛋白在細(xì)胞內(nèi)可以和蛋白激酶B、叉頭族轉(zhuǎn)錄因子O等超過(guò)200種分子相互作用[15],主要依賴靶蛋白上2種特定的14-3-3結(jié)合基序:RSXpS/TXP和RXXXpSXP(pS為磷酸化的絲氨酸,X為任意氨基酸)[1]。由于14-3-3靶蛋白的多樣性,14-3-3蛋白在細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、生存、凋亡、遷移當(dāng)中都起著重要作用[16]。研究表明,外泌體中的14-3-3η通過(guò)與細(xì)胞膜上配體氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)相互作用可以促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α炎性因子的表達(dá),并且促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)MMP-1和MMP-9的表達(dá)[17]。但是,巨噬細(xì)胞本身的14-3-3η對(duì)巨噬細(xì)胞表型和功能的調(diào)控機(jī)制尚未知。

        本研究分析了14-3-3η亞型在骨髓來(lái)源原代巨噬細(xì)胞不同極化狀態(tài)下mRNA表達(dá)水平差異,發(fā)現(xiàn)14-3-3η在M1型巨噬細(xì)胞中表達(dá)較低,M2型巨噬細(xì)胞中表達(dá)較高,據(jù)此推測(cè)14-3-3η可能參與巨噬細(xì)胞的極化。為了進(jìn)一步探究14-3-3η參與巨噬細(xì)胞活化的分子機(jī)制,我們擬原核表達(dá)GST-14-3-3η蛋白。首先對(duì)14-3-3η蛋白氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)其二級(jí)結(jié)構(gòu)中主要為α-螺旋,說(shuō)明其結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定,并且疏水性較差,推測(cè)GST-14-3-3融合蛋白可溶性好,因此選用BL21常規(guī)菌株進(jìn)行原核表達(dá)。其后構(gòu)建pGEX-4T-3-14-3-3η融合表達(dá)載體,成功表達(dá)并純化出較高純度的GST-14-3-3融合蛋白,為后續(xù)在巨噬細(xì)胞中使用GST-pull-down實(shí)驗(yàn)手段研究14-3-3相互作用分子以及其在巨噬細(xì)胞活化和生存上的生物學(xué)功能奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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