顧永春 湯 穎 張燕萍 朱 琦 管學(xué)妹

(蘇州市吳江區(qū)第一人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，蘇州 215200)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種原因不明的自身免疫性疾病，其主要臨床表現(xiàn)為慢性、對(duì)稱性、多發(fā)性外周關(guān)節(jié)炎，以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥、關(guān)節(jié)進(jìn)行性破壞為特征。當(dāng)前臨床藥物治療只能暫時(shí)緩解癥狀，或是減緩疾病的進(jìn)程，但均不能真正治愈RA，也無(wú)法修復(fù)骨與軟骨的破壞，且存在各種藥物副作用[1,2]。

間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)可從機(jī)體各組織中分離獲得，它們具有自我更新及多向分化能力[3]。此外，以往研究表明，MSCs在體內(nèi)及體外均具有免疫調(diào)控能力[4]；在治療RA等自身免疫性疾病上具有廣闊的應(yīng)用前景。尤其是同種異體來(lái)源的骨髓及臍帶MSCs，在臨床試驗(yàn)中應(yīng)用最多，總體被證明是安全、有效的[5,6]。根尖乳頭干細(xì)胞(Stem cells from the apical papilla，SCAP)是存在于未完全發(fā)育成形的恒牙根尖周組織中的成體MSCs，它具有MSCs的基本特征，是牙根發(fā)育成牙本質(zhì)細(xì)胞的重要源，在牙根的形成和發(fā)育中起重要作用；然而目前，對(duì)人SCAP免疫調(diào)節(jié)作用方面的研究較為欠缺[7]。膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(Collagen-induced arthritis，CIA)是最常用的RA動(dòng)物模型，它在臨床癥狀、組織學(xué)、免疫學(xué)等特征上與RA有許多共同點(diǎn)[8]。本研究將評(píng)價(jià)一次性移植人SCAP(hSCAP)能否改善CIA小鼠的炎癥程度。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 SPF級(jí)健康雄性DBA/1J 小鼠(6～8周)26只，體重 18～23 g，購(gòu)自上海靈暢生物科技有限公司；鼠抗人Stro-1-FICE、CD29-PE、CD73-PE、CD90-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD166-PE、CD34-PE、CD45-PE、CD4-PerCP、CD25-APC抗體購(gòu)自BD Biosciences (美國(guó))；抗CD105-PE、Foxp3-PE、IL-17-PE、IL-4-PE和 IFNγ-APC抗體購(gòu)自eBioscience(美國(guó))。

1.2方法

1.2.1SCAP的分離、培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化 臨床采集因正畸拔除的根尖發(fā)育尚未完成的健康前磨牙。無(wú)菌條件下分離根尖牙乳頭，采用組織塊培養(yǎng)法，將切碎的根尖牙乳頭組織碎塊放入培養(yǎng)液37℃、5%CO2條件下用含15%FBS(Gibco，美國(guó))的α-MEM培養(yǎng)基(Hyclone，美國(guó))進(jìn)行培養(yǎng)；每周換液2次。細(xì)胞融合達(dá)80%時(shí)2.5 g/L胰酶消化傳代，取P3代細(xì)胞用于后繼實(shí)驗(yàn)。

1.2.2SCAP干細(xì)胞表面標(biāo)志物鑒定 用PBS將SCAP重懸為2×106ml-1的細(xì)胞懸液，分裝于離心管，每管200 μl。每管分別加2 μl鼠抗人CD29-PE、CD34-PE、CD45-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD146-PE、Stro-1-FICE單克隆抗體，并設(shè)1管空白對(duì)照，4℃避光孵育1 h。然后取得細(xì)胞后PBS洗3次，1 600 r/min離心6 min后重懸于PBS溶液中，流式細(xì)胞儀(BD Calibur，美國(guó))檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物的陽(yáng)性表達(dá)率。

1.2.3成骨、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng) 將SCAP接種于6孔培養(yǎng)板進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，到50%～60%融合時(shí)，將完全培養(yǎng)液換為含50 μg/ml抗壞血酸、0.1 mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油酸鈉的成骨培養(yǎng)液進(jìn)行成骨誘導(dǎo)3周，茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)，評(píng)估SCAP的成骨能力。成脂誘導(dǎo)則換為含0.5 mmol/L IBMX、60 μmol/L吲哚美辛、0.5 μmol/L氫化可的松，10 μg/ml胰島素的成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo)培養(yǎng)2周，油紅O染色觀察其成脂能力。

1.2.4誘導(dǎo)、治療CIA 為了建立CIA小鼠模型，先將雞Ⅱ型膠原(CⅡ)(Chondrex,美國(guó))與完全性弗氏佐劑(CFA)(Chondrex，美國(guó))在冰上混合并完全乳化，而后在DBA/1J 小鼠尾根部皮下注射含100 μg CⅡ的乳劑，21 d后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，注射含100 μg CⅡ與不完全弗氏佐劑(Chondrex)混合配制的乳劑。陰性對(duì)照組(n=6)為正常小鼠，免疫時(shí)在相同部位注射同體積的PBS替代CⅡ乳劑。 初次免疫后第21天，SCAP治療組(n=10)通過CIA小鼠的尾靜脈一次性移植1×106個(gè)SCAP，陽(yáng)性對(duì)照組注射等體積的PBS(n=10)。每周2次記錄關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分及CIA發(fā)病率。計(jì)分方法如下：0分=無(wú)病損，1分=爪子有一個(gè)指頭觀察到腫脹，2分=爪子有一個(gè)以上指頭觀察到腫脹，3分=爪子的所有指頭及爪背腫脹，4分=爪子及踝關(guān)節(jié)嚴(yán)重腫脹，將4個(gè)爪子的評(píng)分相加得到的總分為該小鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分。實(shí)驗(yàn)結(jié)束(第56天)處死小鼠，采集周圍血、脾淋巴細(xì)胞、后肢膝關(guān)節(jié)和足爪作進(jìn)一步研究。

1.2.5流式細(xì)胞分析 采集CIA小鼠的脾臟，并提取淋巴細(xì)胞。取1×106/管的細(xì)胞先用抗CD4抗體在冰上避光條件下孵育30 min，為了分析調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)，需加入1 μg 抗CD25抗體孵育，用Foxp3 染色緩沖液套裝試劑(eBioscience)對(duì)細(xì)胞固定、打孔后,再用1 μg抗Foxp3抗體(檢測(cè)Tregs)、抗IL-4抗體(檢測(cè)Th2)及抗IFN-γ/抗IL-17抗體(分別檢測(cè)Th1和Th17)孵育細(xì)胞。然后用流式分析清洗緩沖液(PBS加0.4% BSA配置)清洗細(xì)胞，最后用流式細(xì)胞分析儀及 FlowJo 10軟件進(jìn)行流式細(xì)胞分析。

1.2.6酶聯(lián)免疫分析 各組CIA小鼠的血清分離后-80℃冰箱保存。血清TNF-α(pg/ml)及抗CⅡ抗體水平(kU/100 ml)檢測(cè)采用ELISA試劑盒。小鼠TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒(Bioscience，美國(guó))及鼠抗雞CⅡ抗體ELISA檢測(cè)試劑盒(Cayman，美國(guó))的使用方法參照產(chǎn)品說(shuō)明書。

1.2.7組織病理學(xué)分析 4%多聚甲醛溶液固定膝關(guān)節(jié)、脫礦、常規(guī)石蠟包埋。6 μm的厚度系列切片并作HE染色。顯微鏡下觀察形態(tài)特點(diǎn)并對(duì)關(guān)節(jié)炎進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)分。按照以往文獻(xiàn)報(bào)道[11]，從滑膜炎癥、血管翳、軟骨及骨質(zhì)侵蝕破壞這3個(gè)方面進(jìn)行評(píng)分：0分=無(wú)炎癥跡象，1分=輕微炎癥、破壞,2分=輕度,3分=中度，4分=重度。

1.2.8顯微CT分析 將小鼠后爪切除后固定于顯微CT樣品臺(tái)中央。顯微 CT(Skyscan1174，布魯克斯，比利時(shí))掃描參數(shù)設(shè)置為：掃描電壓 50 kV，電流800 μA，0.5 mm鋁箔過濾，掃描角度360°，旋轉(zhuǎn)步長(zhǎng)0.7°，空間分辨率設(shè)置為23 μm×23 μm×23 μm。將掃描后獲得的二維圖像進(jìn)行三維重建，不同角度觀察足爪關(guān)節(jié)骨密質(zhì)、骨松質(zhì)及關(guān)節(jié)間隙的破壞狀況。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 SPSS13.0 作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。單因素方差分析及Tukey檢驗(yàn)比較3組間的差異，Student-t檢驗(yàn)比較兩組間均值的差異(病理學(xué)評(píng)分)。P<0.05 視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1hSCAP的培養(yǎng)、鑒定和多向分化 根尖乳頭組織塊培養(yǎng)7 d后，可觀察到SCAP爬出并貼壁生長(zhǎng)。細(xì)胞呈梭形、成纖維細(xì)胞樣，之后增殖形成集落，克隆形態(tài)呈島狀或巢狀，和周圍界限明顯；14 d后集落增大呈漩渦狀，形態(tài)均一。在合適的培養(yǎng)條件下，它們向成骨及成脂方向誘導(dǎo)分化。流式細(xì)胞分析顯示細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34、CD45表達(dá)均為陰性，但CD29、CD73、CD90、CD105、CD166 及Stro-1表達(dá)陽(yáng)性，符合MSCs的特征(圖1)。SCAP在成骨誘導(dǎo)液及成脂誘導(dǎo)液培養(yǎng)條件下能夠分別向成骨礦化與成脂方向分化，3周后茜紅素染色見礦化結(jié)節(jié)形成；2周后油紅染色見串珠樣脂滴形成(圖2)。

圖1 hSCAP細(xì)胞表面標(biāo)志物的流式細(xì)胞分析Fig.1 Flow cytometric analysis of surface molecules of hSCAP

2.2一次性移植hSCAP可以有效減輕CIA的炎癥程度 本研究中，CIA陽(yáng)性對(duì)照組(n=10，注射PBS)與SCAP移植治療組(n=10)的20只DBA/1J小鼠用Ⅱ型膠原蛋白免疫后出現(xiàn)不同程度的關(guān)節(jié)炎癥狀，對(duì)照組CIA發(fā)病率100%，SCAP治療組發(fā)病率90%，單從發(fā)病率看，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖3B)。但從關(guān)節(jié)炎指數(shù)均值看，hSCAP治療組的評(píng)分顯著低于PBS陽(yáng)性對(duì)照組(圖3C)，提示SCAP移植具有減輕炎癥的治療效果。組織病理分析提示，SCAP治療組在移植后35 d，炎癥程度(滑膜炎、血管翳形成、軟骨和骨的侵蝕破壞程度)均比對(duì)照組輕(圖3D、E)。顯微CT分析進(jìn)一步證實(shí)SCAP細(xì)胞治療的有效性：CIA組小鼠后爪觀察到嚴(yán)重的骨質(zhì)破壞與侵蝕，關(guān)節(jié)間隙變得不規(guī)則，皮質(zhì)骨缺損與骨質(zhì)沉積并存，骨密度下降，而SCAP組關(guān)節(jié)破壞程度明顯減輕(圖3F)。ELISA分析顯示一次性移植SCAP能降低CIA小鼠血清抗CⅡ特異性 IgG 抗體以及促炎細(xì)胞因子TNF-α的水平(圖3G、H)。

圖2 hSCAP的培養(yǎng)與多向誘導(dǎo)分化(×40)Fig.2 Culture and multipotent differentiation of hSCAP (×40)Note:A.SCAP migrate from the pieces of tissue,and adhere to the plastic cell culture plate,exhibiting spindle-like shape in vitro (P0);B.The cell colonies of SCAP are fused together,exhibiting whirlpool-like shape (P3);C.Alizarin red staining for calcium showed the mineralization potential of SCAP after osteogenic differentiation;D.Oil red staining for lipid droplets showed the adipogenic potential of SCAP after adipogenic differentiation.

圖3 hSCAP移植能緩解CIA小鼠的炎癥癥狀Fig.3 hSCAP transplantation attenuated inflammatory responses in collagen-induced arthritis (CIA) miceNote:A.Arthritis severity scores system (representative images of swollen hind paws ranging from normal to grossly swollen;from left to right the score is 0-4,respectively);B.The CIA incidence shows no significant difference between the positive control(CIA+PBS) and CIA+SCAP groups (100% vs 90%,P>0.05);C.Arthritis severity scores of 3 mice groups (normal,CIA+PBS and CIA+SCAP) were determined at various time points after immunization;D.Comparisons of the histological analysis (score) of knees of 2 mice groups (CIA+SCAP and CIA+SCAP);E.Representative histological images of knees of 3 mice groups(HE staining,pannus is indicated by an arrow,×40);F.Micro-CT analysis of the joint defections of the hind paws of 3 mice groups (representative images of 3D reconstruction);G.Anti-CⅡ IgG,analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)；H.Serum concentrations of tumor necrosis factor α (TNF-α) analyzed by ELISA;*.P<0.05,**.P<0.01,ns.P>0.05.

圖4 hSCAP移植能影響CIA小鼠脾臟Th細(xì)胞的極化(流式分析)Fig.4 hSCAP transplantation influenced polarization of Th cells(Flow cytometry)Note:A.FlowJo software was used to gate CD4+ Th and CD25+ Foxp3+ Tregs;representative flow cytometry data show Tregs in the spleens of 3 mice groups;B.SCAP can significantly decrease the percentage of CD4+IFN-γ+ Th1 and CD4+IL-17+ Th17 cells in the mouse spleen,and increase the percentage of CD4+CD25+FoxP3+ Tregs;whereas the difference in the percentage of Th2 has no statistical significance.*.P<0.05,**.P<0.01,ns.P>0.05.

2.3hSCAP移植會(huì)影響CIA小鼠脾臟輔助性T細(xì)胞(Th)亞群比例的改變 對(duì)脾臟CD4+Th細(xì)胞的流式細(xì)胞分析顯示，hSCAP移植能顯著降低CIA小鼠脾臟CD4+IFN-γ+Th1 及CD4+IL-17+Th17 的百分比，上調(diào)CD25+FoxP3+Tregs的百分比，而Th2的比例在各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖4)。

3 討論

近年來(lái)，MSCs的免疫調(diào)控功能日益受到關(guān)注，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)，越來(lái)越多證據(jù)表明MSCs移植在治療自身免疫性疾病上總體是安全、有效的[2,5,6,9-11]。但由于研究方法及疾病種類的差異(如供體MSCs的種類、移植細(xì)胞劑量和移植次數(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)方法及細(xì)胞狀態(tài)的不同導(dǎo)致治療步驟缺乏標(biāo)準(zhǔn)化)，在MSCs治療RA或CIA時(shí)，治療效果有時(shí)并不肯定[12]。加上目前關(guān)于MSCs發(fā)揮免疫調(diào)控作用的詳細(xì)分子機(jī)制尚不清楚，在許多問題上仍存在爭(zhēng)議。

SCAP是具有高度增生、自我更新能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞；是牙根發(fā)育成牙本質(zhì)細(xì)胞的重要源，在牙根的形成和發(fā)育中起著重要的作用[13]。它增殖速度快，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)相比，更容易從口腔科臨床獲得，并且受倫理學(xué)限制較小。以往對(duì)SCAP的研究主要集中在牙體組織再生及生物學(xué)牙根組織工程領(lǐng)域；關(guān)于SCAP的免疫調(diào)控作用方面的研究報(bào)道較為少見。Ding等[7]分離、培養(yǎng)了小型豬SCAP，體外實(shí)驗(yàn)證明SCAP對(duì)自體及同源異體T細(xì)胞增殖具有抑制作用，并呈濃度依賴性；但尚未見關(guān)于SCAP移植治療實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎或臨床試驗(yàn)治療RA的報(bào)道。本研究從口腔科臨床采集健康牙根未完全發(fā)育完成的離體牙，因正畸原因拔除的前磨牙或阻生的第三磨牙最為常見。我們從根尖乳頭中分離、鑒定了SCAP，流式細(xì)胞分析顯示，SCAP具有和BMSCs相似的干細(xì)胞表面標(biāo)志譜(圖1)，通過誘導(dǎo)培養(yǎng)，可以表現(xiàn)出多向分化能力，能向成骨與成脂兩個(gè)方向分化(圖2)。CIA是研究RA最常用的動(dòng)物模型，在探索治療RA的新方法、新藥物時(shí)被廣泛使用。2007年，Augello等[14]最早報(bào)道一次性移植異種的人BMSCs可以治療CIA，減輕小鼠關(guān)節(jié)出現(xiàn)的嚴(yán)重不可逆性的軟骨及骨損傷。本研究采用雄性的DBA/1J小鼠成功誘導(dǎo)制作了CIA動(dòng)物模型，其陽(yáng)性對(duì)照組發(fā)病率100%。通過一次性尾靜脈注射hSCAP評(píng)估其治療實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎的效果，從而為RA的細(xì)胞治療探索新的MSCs來(lái)源，也為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)SCAP的免疫調(diào)控特性積累實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)證明，一次性靜脈輸注異種基因的hSCAP可以有效緩解小鼠實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎的臨床癥狀，組織病理分析及免疫檢測(cè)指標(biāo)均提示炎癥的嚴(yán)重程度得到緩解。圖3提示，與CIA陽(yáng)性對(duì)照組相比，SCAP治療組關(guān)節(jié)炎發(fā)病率為90%，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分均值明顯降低(12.2比8.7)，減小了近30%；血清C Ⅱ 特異性IgG抗體水平及TNF-α濃度分別減小了近60%(2 285 kU/ml比942 kU/ml)及35%(12.1 pg/ml比7.8 pg/ml)；病理學(xué)評(píng)分顯示，SCAP治療組滑膜炎、血管翳、軟骨及骨破壞的評(píng)分均有明顯下降，顯微CT對(duì)關(guān)節(jié)骨破壞的分析與病理分析一致；上述結(jié)果表明SCAP確實(shí)能下調(diào)免疫反應(yīng)、減小關(guān)節(jié)軟、硬組織的損傷。

以往研究提示，T淋巴細(xì)胞在RA的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中起著重要的作用；傳統(tǒng)認(rèn)為，RA為Th1驅(qū)動(dòng)的自身免疫疾病，Th1/Th2比例失衡在RA發(fā)病過程中起重要作用[15]。而近年來(lái)，Th17在關(guān)節(jié)炎癥、破壞中的作用正越來(lái)越受到重視，Th17在RA及CIA病灶部位高表達(dá)，并與疾病的炎癥程度相一致；其主要效應(yīng)因子IL-17是強(qiáng)大的前炎癥細(xì)胞因子，是炎癥反應(yīng)重要的微調(diào)因子[16]。而Treg在抑制各種自身免疫反應(yīng)、維持免疫耐受的機(jī)制中居于中心地位[17]。Augello等[14]指出，異基因MSCs移植后并不能在體內(nèi)長(zhǎng)期存活，因此干細(xì)胞治療能發(fā)揮長(zhǎng)期免疫抑制作用并非依賴MSCs的活力，而是要?dú)w因于抗原特異性激活Treg克隆，從而誘導(dǎo)免疫耐受。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CIA陽(yáng)性對(duì)照組小鼠的Th1和Th17均有升高，而CD4+Th細(xì)胞中Treg水平卻明顯降低。SCAP移植后能上調(diào)脾臟Treg水平(從5.4%升高到8.1%)而顯著降低Th1及Th17水平，從而導(dǎo)致免疫耐受，降低炎癥的嚴(yán)重程度；Th2水平略有升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。因此，SCAP具有與BMSCs相似的免疫調(diào)控特征，能夠幫助個(gè)體恢復(fù)T細(xì)胞亞群間的穩(wěn)態(tài)，將來(lái)有望用于RA的臨床治療。

我們先前曾證明，小鼠牙齦間充質(zhì)細(xì)胞移植能有效減輕CIA的炎癥程度，F(xiàn)as/Fas配體(FasL)信號(hào)通路在MSCs誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡中起重要作用，是發(fā)揮免疫抑制作用的重要機(jī)制之一[2]。然而，對(duì)MSCs免疫調(diào)控作用的分子機(jī)制遠(yuǎn)未清楚，已知一系列細(xì)胞因子被發(fā)現(xiàn)可能參與其中，如TGF-β、IL-10、前列腺素E2、NO、吲哚胺2,3-二加氧酶(Indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)[9,18]。以往研究顯示，MSCs能夠克服個(gè)體間MHC的不匹配；在動(dòng)物模型上，同種異體或是異種MSCs均有調(diào)節(jié)免疫的治療效果[19]，但其發(fā)揮免疫抑制作用的效率及機(jī)制可能并不相同。本研究中我們將異種的hSCAP移植給CIA小鼠，包括動(dòng)物模型制作方法、干細(xì)胞提取及培養(yǎng)方法、注射細(xì)胞途徑、劑量、注射時(shí)間點(diǎn)等步驟均與以往用同種異基因的小鼠牙齦MSCs移植治療相似[2]，并取得了相似的治療效果。Su等[20]比較了不同物種來(lái)源的MSCs免疫抑制作用的特點(diǎn)，并研究不同物種MSCs介導(dǎo)免疫抑制作用的核心分子；發(fā)現(xiàn)在相同的培養(yǎng)條件下，人、獼猴及豬來(lái)源的MSCs主要通過IDO途徑來(lái)發(fā)揮其免疫抑制作用，而小鼠、大鼠、地鼠及兔來(lái)源的MSCs則是通過iNOS途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)其免疫抑制功能。鑒于此，作者將進(jìn)一步設(shè)計(jì)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證IDO及其他可能的因素在hSCAP治療CIA機(jī)制中所起的作用，但從目前已經(jīng)掌握的知識(shí)來(lái)看，其詳細(xì)的機(jī)制非常復(fù)雜，各種機(jī)制相互交織、相互影響，這仍有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本研究表明，靜脈移植hSCAP能誘導(dǎo)CIA小鼠T細(xì)胞亞群平衡及免疫耐受，從而有效減輕關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度。

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