陳海鳳 鄒耀紅 孫凌云

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，無(wú)錫 214023)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)是一種自身免疫性疾病，主要表現(xiàn)為自身抗體生成、多器官受累，其發(fā)病機(jī)制在于T、B淋巴細(xì)胞免疫異常，大量自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及免疫復(fù)合物沉積等致靶器官損傷[1]。

間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cell，MSC)是一種非造血、多潛能的祖細(xì)胞，可分化成脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、肌細(xì)胞等，因其低免疫原性及免疫調(diào)節(jié)作用，近年來(lái)在自身免疫病方面的作用得到了較多關(guān)注。大量研究表明MSC移植治療MRL/lpr鼠或狼瘡患者，均可緩解狼瘡病情[2]。MSC可抑制T、B淋巴細(xì)胞活化增殖及減少抗體生成，如調(diào)節(jié)性T(Treg)細(xì)胞[3]、Th17細(xì)胞[4]、濾泡輔助T(Tfh)細(xì)胞[5]、B淋巴細(xì)胞[6]等。

SLE患者自體骨髓MSC已證實(shí)存在異常，表現(xiàn)在遷移、衰老及凋亡等方面，其對(duì)免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用亦明顯受損[2，7-9]。此外，我們前期研究發(fā)現(xiàn)SLE血清微環(huán)境體外可加劇MSC異常衰老[10]，其中異常升高的瘦素起到主導(dǎo)作用[11]。然而瘦素除誘導(dǎo)MSC衰老外，對(duì)免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用是否受損目前則尚未明確。因此本研究旨在觀察瘦素誘導(dǎo)產(chǎn)生的衰老MSC其免疫調(diào)節(jié)作用是否受到影響，為闡述SLE的發(fā)病機(jī)制提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)試劑 培養(yǎng)基(DMEM/F12、1640)、青/鏈霉素(Penicillin/Streptomycin)、胎牛血清(FBS)、磷酸鹽緩沖液 (PBS)(Gibco公司)；人淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰?；重組人瘦素(Peprotech公司)；流式標(biāo)記抗體(CD4、CD25、Foxp3、IL-17、CD3、CD69、PD-1、CXCR5、CD19)(BD公司)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)對(duì)象 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院風(fēng)濕免疫科2014年1月至2014年7月收住院的10例女性SLE患者，診斷符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)1997年修訂的SLE分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，均處于活動(dòng)期，SLEDAI評(píng)分>6分。收集上述人群的外周血，分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。臍帶組織來(lái)自南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院婦產(chǎn)科健康產(chǎn)婦，無(wú)自身免疫病病史或家族史。

1.2方法

1.2.1臍帶MSC分離培養(yǎng) 臍帶無(wú)菌采集后，于保存液中4℃保存，在24 h內(nèi)處理。無(wú)菌狀態(tài)下，采用無(wú)菌器械，分離剝?nèi)∧殠е械娜A通氏膠組織，去除靜脈及動(dòng)脈，將膠組織剪成1 mm3的小塊接種入T75培養(yǎng)瓶中，采用含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于溫度37℃、5%CO2的溫箱中。每3～5 d 換液1次，在倒置顯微鏡下觀察，生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，采用0.25%的胰酶消化處理，收集懸浮細(xì)胞，洗滌后，按照1∶3的比例傳代接種，擴(kuò)增，備用。在每次細(xì)胞傳代時(shí)，采用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算細(xì)胞活力，要求大于95%，細(xì)胞凍存后復(fù)蘇活力大于85%。干細(xì)胞純度：流式細(xì)胞儀檢測(cè)，陽(yáng)性指標(biāo)CD73、CD90、CD105表達(dá)率>95% ，陰性指標(biāo)CD14、CD19、CD34、CD45、 HLA-DR表達(dá)率<2%。

1.2.2淋巴細(xì)胞培養(yǎng)及測(cè)定 MSC與PBMC以1∶10 共培養(yǎng) 3 d， 收集PBMC，PBS洗滌一遍，流式細(xì)胞儀測(cè)定不同的細(xì)胞亞群。Treg細(xì)胞測(cè)定：常溫避光標(biāo)記CD4-FITC，CD25-APC，按照BD公司human Foxp3 buffer set步驟將細(xì)胞破膜，標(biāo)記Foxp3-PE抗體，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例。Tfh細(xì)胞測(cè)定：常溫避光標(biāo)記CD4-FITC、CXCR5-APC、PD-1-PerCP-Cy5.5，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+CXCR5+PD-1+Tfh細(xì)胞比例。Th17細(xì)胞：加入PMA、離子霉素、BFA，在37℃ 5%CO2孵箱共刺激4～6 h，細(xì)胞表面標(biāo)記CD4-FITC，固定、破膜，胞內(nèi)染色I(xiàn)L-17-APC，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+IL-17+Th17細(xì)胞比例。B淋巴細(xì)胞：常溫避光表面標(biāo)記CD19-PE/Cy5，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD19+B淋巴細(xì)胞比例。

2 結(jié)果

2.1瘦素預(yù)處理MSC對(duì)Treg細(xì)胞調(diào)節(jié)作用的影響 體外以重組人瘦素(100 ng/ml)加入MSC培養(yǎng)基(DMEM/F12+10%FBS)培養(yǎng)3 d，然后棄培養(yǎng)液再與SLE患者PBMC(1∶10)共培養(yǎng)3 d。結(jié)果發(fā)現(xiàn)臍帶MSC上調(diào)Treg細(xì)胞比例[(8.53±2.33) % vs (5.96±1.22)%，P<0.01]，與未處理組相比較，瘦素預(yù)處理的MSCs上調(diào)Treg細(xì)胞的能力下降[(6.79±2.14)% vs (8.53±2.33)%，P<0.01]，如圖1。通過(guò)共培養(yǎng)瘦素預(yù)處理的MSC與PBMC，發(fā)現(xiàn)瘦素預(yù)處理MSC使其上調(diào)Treg細(xì)胞的能力明顯受損。

圖1 瘦素預(yù)處理MSC前后對(duì)Treg細(xì)胞調(diào)節(jié)作用的影響Fig.1 Effects of MSC treated with or without leptin on frequency of Treg cells(±s)Note:**.P<0.01.

圖2 瘦素預(yù)處理MSC對(duì)其調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞的影響Fig.2 Effects of MSC treated with or without leptin on frequency of Th17 cellsNote:**.P<0.01.

圖3 瘦素預(yù)處理MSC對(duì)其調(diào)節(jié)Tfh細(xì)胞的影響Fig.3 Effects of MSC treated with or without leptin on frequency of Tfh cellsNote:***.P<0.001;ns.P>0.05.

GroupsCD3+TcellCD25MFICD69MFICD19+BcellCD25MFICD69MFIPBMC12 06±4 6212 67±4 7422 43±2 468 56±2 37MSC+PBMC9 63±3 601)11 87±4 1719 16±3 621)9 14±1 34Leptin?MSC+PBMC10 67±4 032)12 71±4 292)21 05±2 362)10 09±1 93

Note：PBMC.Peripheral blood monocyte cell;MSC.Mesenchymal stem cell;Leptin-MSC.MSC pretreated with leptin for 3 days;MFI.Median fluorescence intensity.1)P<0.05，compared with PBMC group;2)P<0.05,compared with MSC+PBMC group.

2.2瘦素預(yù)處理MSC對(duì)Th17細(xì)胞及Tfh細(xì)胞調(diào)節(jié)功能的影響 瘦素100 ng/ml預(yù)處理MSC 3 d后， 1∶ 10與SLE患者PBMC共培養(yǎng)3 d。結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常臍帶來(lái)源的MSC可下調(diào)Th17細(xì)胞[(1.28±0.70)% vs (2.01±0.72)%，P<0.01]、Tfh細(xì)胞[(1.48±1.36)% vs (8.80±1.94)%，P<0.001]。而與未處理組相比較，瘦素預(yù)處理的MSC對(duì)Th17細(xì)胞下調(diào)作用受到抑制[(1.64±0.55)% vs (1.28±0.70)%，P<0.01]，而Tfh細(xì)胞比例有增加的趨勢(shì)[(2.08±1.52)% vs (1.48±1.36)%，P=0.051]，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果如圖2、3所示。因此瘦素預(yù)處理MSC使其體外作用下調(diào)Th17細(xì)胞的能力受損，而本研究中對(duì)Tfh細(xì)胞調(diào)節(jié)能力改變無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可增加樣本量進(jìn)一步明確。

2.3瘦素預(yù)處理干擾MSC對(duì)SLE患者B淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用 重組人瘦素100 ng/ml加入MSC培養(yǎng)基預(yù)處理3 d，棄上清，再以1∶10與PBMC共培養(yǎng)3 d。結(jié)果檢測(cè)可見(jiàn)MSC體外降低SLE患者B細(xì)胞比例[(6.78±3.38)% vs (8.40±2.57) %，P<0.05]，而瘦素預(yù)處理后使得B細(xì)胞比例較前部分升高[(7.37±3.56)% vs (6.78±3.38)%，P<0.05]。說(shuō)明瘦素預(yù)處理MSC可損傷其對(duì)B細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，但對(duì)其亞群(如調(diào)節(jié)性B細(xì)胞、漿細(xì)胞等)作用如何仍需進(jìn)一步研究。

2.4瘦素預(yù)處理的MSC對(duì)T、B淋巴細(xì)胞活性的影響 MSC對(duì)免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，除了細(xì)胞比例、功能外，還與細(xì)胞活性密切相關(guān)。本研究瘦素(100 ng/ml)預(yù)處理MSC與PBMC(1∶10)共培養(yǎng)3 d，檢測(cè)CD25、CD69代表T、B淋巴細(xì)胞活性。MSC降低CD3+T細(xì)胞表面CD25熒光強(qiáng)度[(9.63±3.60) vs (12.06±4.62)，P<0.05]，而對(duì)CD69的表達(dá)無(wú)明顯改變[ (11.87±4.17) vs (12.67±4.74)，P>0.05]。與單獨(dú)MSC組相比，瘦素作用可部分上調(diào)MSC對(duì)T細(xì)胞活化分子CD25、CD69熒光強(qiáng)度[CD25 (10.67±4.03) vs (9.63±3.60)，P<0.05；CD69 (12.71±4.29) vs (11.87±4.17)，P<0.05]。而在B淋巴細(xì)胞活化方面，MSC下調(diào)CD19+B細(xì)胞表面CD25熒光強(qiáng)度[(19.16±3.62) vs (22.43±2.46)，P<0.05]，瘦素處理后CD25表達(dá)強(qiáng)度較前有增加[(21.05±2.36) vs (19.16±3.62)，P<0.05]。瘦素處理前后MSC對(duì)B細(xì)胞表面CD69的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。故MSC體外可抑制T、B淋巴細(xì)胞活化，而瘦素則一定程度損傷了MSC對(duì)免疫細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)能力。

3 討論

SLE是全身性免疫性疾病，表現(xiàn)為免疫細(xì)胞過(guò)度活化、促炎因子增加，炎癥細(xì)胞及因子在組織器官浸潤(rùn)，導(dǎo)致多臟器功能受損。目前臨床治療仍以激素、免疫抑制劑治療為主，近年來(lái)CD20單抗、BAFF單抗等靶向藥物逐漸應(yīng)用于臨床。

瘦素不僅參與代謝，還參與了免疫及炎癥反應(yīng)，尤其在狼瘡疾病方面的作用得到了廣泛關(guān)注[12]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)瘦素可導(dǎo)致狼瘡鼠自身抗體的產(chǎn)生、蛋白尿增多、腎臟病理加劇，而中和阻斷瘦素則明顯延長(zhǎng)小鼠存活時(shí)間[13]，且瘦素缺乏則可增加Treg細(xì)胞、降低Th17細(xì)胞，并逆轉(zhuǎn)狼瘡鼠病情[14,15]。我們亦證實(shí)瘦素在狼瘡患者及動(dòng)物模型中顯著增高，因此瘦素在狼瘡發(fā)病及其發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用值得我們深入探討。

MSC是一種多潛能細(xì)胞，具有多向分化潛能，且表達(dá)CD105、CD90、CD73，缺乏造血細(xì)胞標(biāo)記。MSC表達(dá)主要組織相容復(fù)合物(MHC)Ⅰ類(lèi)分子，而不表達(dá)MHCⅡ類(lèi)分子及共刺激分子(CD40、CD80、CD86)，這決定了MSC的低免疫原性。MSC具備免疫調(diào)節(jié)作用，其通過(guò)可溶性細(xì)胞因子或細(xì)胞間接觸等方式，能夠抑制T細(xì)胞增殖、DC細(xì)胞分化、Treg細(xì)胞數(shù)量及功能以及B細(xì)胞增殖等。臨床研究發(fā)現(xiàn)骨髓或臍帶來(lái)源MSC移植治療SLE患者或狼瘡鼠模型能夠獲得良好的療效[16]。我們前期研究證實(shí)了SLE患者自身骨髓來(lái)源MSC多種異常，主要表現(xiàn)為異常衰老、凋亡[8]，其對(duì)T、B淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)亦明顯受損[9]。此外，SLE患者血清已證實(shí)可加劇MSC的衰老，而在此過(guò)程中瘦素起至關(guān)重要的作用[11]。本研究則在異常升高的瘦素促進(jìn)MSC細(xì)胞衰老的同時(shí)，發(fā)現(xiàn)其預(yù)處理MSC對(duì)免疫細(xì)胞數(shù)量及活化的調(diào)控功能亦受明顯受損。

國(guó)內(nèi)外研究均表明SLE患者循環(huán)Treg細(xì)胞減少，F(xiàn)oxp3表達(dá)降低，不能有效抑制效應(yīng)T細(xì)胞的增殖及細(xì)胞因子分泌[17]；而Th17細(xì)胞增多，在組織器官聚集浸潤(rùn)，產(chǎn)生大量IL-17，進(jìn)而導(dǎo)致組織損傷[18]；同時(shí)，Tfh細(xì)胞數(shù)量增加，促進(jìn)B細(xì)胞過(guò)度活化，生發(fā)中心生成及自身抗體的異常增加，從而導(dǎo)致狼瘡發(fā)病[19]。MSC則可通過(guò)細(xì)胞間接觸及分泌可溶性細(xì)胞因子(如吲哚胺2，3雙加氧酶、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、白介素-10、前列腺素E2、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、人類(lèi)白細(xì)胞抗原G5、一氧化氮等)的方式，增強(qiáng)Treg細(xì)胞免疫抑制功能[20]、抑制Th17細(xì)胞[21]及Tfh細(xì)胞的促炎作用[22]。而本研究則發(fā)現(xiàn)瘦素預(yù)處理明顯損傷MSC對(duì)Treg細(xì)胞、Tfh細(xì)胞的免疫調(diào)控作用。瘦素作用的MSC對(duì)Tfh細(xì)胞抑制作用受到一定程度影響，但差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與研究例數(shù)偏少有關(guān)，可增加樣本量進(jìn)一步探討。

B淋巴細(xì)胞在SLE疾病發(fā)生發(fā)展中的作用尤其關(guān)鍵，主要表現(xiàn)為異?；罨爱a(chǎn)生自身抗體異常增多[23]。本研究發(fā)現(xiàn)MSC可下調(diào)B淋巴細(xì)胞比例、抑制其免疫活性，瘦素作用后MSC調(diào)節(jié)B細(xì)胞、抑制其活化等能力均減弱。與此同時(shí)，國(guó)內(nèi)研究者亦發(fā)現(xiàn)SLE血漿培養(yǎng)條件可負(fù)性調(diào)控MSC對(duì)B細(xì)胞比例、增殖、成熟的抑制作用[24]。雖然Crop等提出某些炎癥細(xì)胞因子可增強(qiáng)MSC免疫抑制功能，如干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α、白介素-1a/b等[25]，這可能導(dǎo)致上述促炎因子靶向阻斷后狼瘡鼠自體骨髓MSC功能受損，進(jìn)而影響療效；然而體外如以上述因子預(yù)處理MSC，再輸注治療狼瘡可能一定程度上增強(qiáng)其免疫抑制作用。本研究首次發(fā)現(xiàn)瘦素在體外環(huán)境中作用可損傷MSC對(duì)免疫細(xì)胞的調(diào)控能力，此外，瘦素已有報(bào)道可直接作用于多種免疫細(xì)胞促進(jìn)其免疫活化，因此我們認(rèn)為靶向阻斷瘦素可能成為SLE患者潛在的有效治療方法，然而其療效及安全性如何、對(duì)B細(xì)胞抗體分泌及調(diào)節(jié)性B細(xì)胞作用、相關(guān)信號(hào)及分子機(jī)制等有待進(jìn)一步研究闡明。

綜上，瘦素不僅促進(jìn)MSC細(xì)胞衰老，還損傷其對(duì)免疫細(xì)胞的調(diào)控作用，故瘦素可能通過(guò)加劇MSC衰老、損傷其免疫調(diào)節(jié)功能而加重狼瘡病情，為闡明SLE發(fā)病機(jī)制及可能的治療靶點(diǎn)提供新的理論依據(jù)。

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