蘭紅云 鄭曉丹 郭鈺琪 安 磊 孫曉艷 呂衍民 王 麗 姚成芳

(濟南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，濟南 250200)

肺臟是氣體交換的主要部位，時刻受到外源性病原微生物、過敏原及微粒狀污染物的威脅，是各種病原體入侵的主要門戶，因此，需要有效的免疫防御機制來保護其免受有害物質(zhì)的損傷，維持正常功能。肺組織自身的黏膜免疫屏障功能既可抵抗外界病原體的入侵，又可促進其降解[1]，天然免疫系統(tǒng)在這一過程中起主導(dǎo)作用,其中，NK細胞因其強大的抗腫瘤、抗病毒效應(yīng)在維持肺臟免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中扮演了重要角色[2]。

NK細胞是機體抗感染的第一道防線，受組織局部CXCL9、CXCL10等不同趨化因子的調(diào)控，在不同組織器官分布狀態(tài)不同[3,4]。肺臟是NK細胞大量分布的重要器官之一，肺臟NK細胞通過快速、大量分泌IFN-γ、穿孔素和顆粒酶等效應(yīng)因子，在免疫監(jiān)視和免疫清除過程中發(fā)揮重要作用[5]。因此，NK細胞在肺臟局域免疫中起著關(guān)鍵作用。肺臟局部NK細胞的趨化和募集能力是體現(xiàn)肺臟抗腫瘤免疫的重要保障，但肺臟局部調(diào)控NK細胞募集的關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點尚待明確。

有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，IL-17家族對細胞的遷移和趨化有很強的調(diào)控作用：IL-17 家族成員可通過調(diào)控多種趨化因子招募嗜中性粒細胞和其他先天免疫細胞局部募集[6]。IL-17D屬于IL-17家族，與腫瘤的侵襲密切相關(guān)[7]。但是IL-17D對肺臟NK細胞的募集有怎樣的調(diào)控作用尚無人報道。本研究旨在探討IL-17D調(diào)控肺臟NK細胞募集的分子機制及黃芪的作用。

黃芪(Astragalus membranaceus，AG)是經(jīng)典的補益肺氣中藥[8]，味甘性溫，歸肺脾二經(jīng)，通過益氣固表、養(yǎng)心通脈等功效，保護肺氣的充實和穩(wěn)定[9]。但黃芪調(diào)控肺臟NK細胞的募集及其藥理機制尚無報道。我們研究發(fā)現(xiàn)，黃芪補益肺氣的關(guān)鍵作用機理之一是上調(diào)肺臟IL-17D的表達和NK細胞含量，促進肺臟抗腫瘤效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物 本實驗采用SPF級雌性C57BL/6小鼠，周齡6～7周，體重(18.29±1.41)g，購于濟南朋悅實驗動物繁育中心。飼養(yǎng)于室溫 22～26℃，相對濕度45%～55%的IVC動物層流柜。

1.1.2藥物 中藥黃芪購自山東省人民藥業(yè)有限公司(批號160909)，經(jīng)該公司鑒定為豆科植物黃芪的干燥根部切片。稱取適量的黃芪生品，常規(guī)法水煎、醇沉、回收乙醇，制成含黃芪生藥0.0625 g/ml原液，滅菌后儲存于4℃冰箱，用于小鼠常規(guī)飲用給藥。

1.1.3主要試劑與儀器 RNA提取所用試劑：總RNA提取試劑Trizol Reagent(LOT03877/10125)購自北京康為世紀生物科技有限公司；DEPC水(LJ0113B2011T)購自AMRESCO公司。無水乙醇、異丙醇、氯仿等試劑購自天津市鑫達醫(yī)藥化工試劑有限公司。Reverse Transcription PCR(RT-PCR)所用試劑：M-MLV購于Fermentas公司；Oligo dT購于Thermo Scientific公司；RNA酶抑制劑、dNTP、2×Taq Master DNA聚合酶等試劑均購于北京康為世紀生物科技有限公司；內(nèi)參磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、CXCL-9、IL-15等引物(見表1)均由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司合成。佛波酯(Phorbol myristate acetate,PMA)、離子霉素(Ionomycin)和蛋白轉(zhuǎn)錄抑制劑(BFA)均購自Sigma 公司。PE-Cy5-CD3、PE-NK1.1、PE-IL-17D等大鼠抗小鼠抗體均購自美國BD公司。FACS verse流式細胞儀購自美國BD公司。

表1引物序列

Tab.1Primersequence

GeneUpstream(5′?3′)Downstream(5′?3′)GAPDHACCACAGTCCATGCCATCACTCCACCACCCTGTTGCTGTAIL?15CATCCATCTCGTGCTACTTGTGGCCTCTGTTTTAGGGAGACCTCXCL?9CGGACTTCACTCCAACACAGTAGGGTTCCTCGAACTCCACIL?17DGGGCGTACAGGATTTCCTACAGAGAAGACGGGTGTGCTG

1.2實驗方法

1.2.1實驗分組及模型建立 將C57BL/6雌性小鼠隨機分為4組，即正常對照組、B16模型組、B16模型+IL-17D滴鼻實驗組、B16模型+黃芪組，每組6只。正常對照組自由飲水攝食。B16肺癌模型給予B16細胞2×105個/300 μl/只尾靜脈注射。1周后，B16注射+IL-17D滴鼻實驗組給予IL-17D制劑40 μl/只滴鼻，連續(xù)一周，B16模型+黃芪組給予黃芪制劑常規(guī)飲用至實驗結(jié)束，劑量為0.062 5 g/(kg·d)。

1.2.2胞內(nèi)外染色法檢測IL-17D、NK細胞含量 實驗結(jié)束后，無菌沖洗并分離小鼠肺臟，經(jīng)研磨過濾制成肺組織單細胞懸液，RPMI1640重懸細胞并調(diào)整濃度至5×106個/ml，接種于24孔板，根據(jù)經(jīng)典方法檢測IL-17D、NK細胞含量[10]。主要步驟：PMA等刺激培養(yǎng)5 h后，收集細胞，1×PBS洗滌，封閉Fc受體，加入適量熒光抗體(PE-Cy5-CD3、PE-NK1.1)，4℃避光孵育30 min，洗滌后，采用BD固定穿膜試劑盒穿膜固定，加入適量PE-IL-17D抗體，4℃避光孵育1 h，經(jīng)穿膜緩沖液及PBS洗滌后，用流式細胞儀檢測并分析NK細胞(CD3-NK1.1+)及IL-17D(IL-17D+)的比例和數(shù)量。

1.2.3RT-PCR法檢測各細胞因子mRNA表達水平 根據(jù)TRIZOL201法提取肺組織總RNA；經(jīng)ND-1000分光光度儀檢測RNA的純度與含量，調(diào)整RNA濃度進行RT反應(yīng)；采用25 μl總反應(yīng)體系經(jīng)預(yù)變性、變性、退火、延伸等過程完成PCR反應(yīng)；PCR擴增結(jié)束后采用1.5%瓊脂糖凝膠(EB染色)水平電泳；使用Alpha凝膠成像系統(tǒng)顯影：以GAPDH為內(nèi)參照，計算目的基因片段相對表達量。

2 結(jié)果

2.1肺臟腫瘤誘導(dǎo)局部IL-17D及其NK細胞含量顯著下降 在小鼠B16肺癌轉(zhuǎn)移模型中，RT-PCR和流式細胞分析結(jié)果顯示肺臟局部IL-17D基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平較野生型小鼠顯著降低(P<0.01)，結(jié)果見圖1A～C。同時，小鼠肺腫瘤組織中NK細胞比例較正常對照小鼠明顯減少(P<0.01)，見圖2A、B。

2.2IL-17D上調(diào)肺腫瘤組織NK細胞含量抑制腫瘤克隆形成 在小鼠肺癌模型中我們觀察到IL-17D表達水平與NK細胞含量降低發(fā)生同步改變，為進一步證明腫瘤組織中IL-17D表達變化與NK細胞含量降低的直接關(guān)系，本研究采用IL-17D經(jīng)鼻回補方法，在小鼠肺癌模型中，進一步觀察IL-17D對肺臟NK細胞含量的影響及其腫瘤克隆的形成狀態(tài)。結(jié)果顯示：B16模型小鼠經(jīng)IL-17D制劑滴鼻處理后，肺腫瘤克隆數(shù)較B16模型組明顯減少(P<0.01),見圖3A、B，同時，肺臟NK細胞含量顯著升高(P<0.01)，見圖3C。由此我們推斷，IL-17D是影響肺臟局部NK細胞含量的重要細胞因子，是肺臟NK細胞發(fā)揮抗腫瘤作用的重要分子基礎(chǔ)。

圖1 B16肺轉(zhuǎn)移模型中IL-17D表達下降 Fig.1 Reduction of IL-17D in lung with B16 melano-ma metastasisNote: **.P<0.01

2.3IL-17D上調(diào)肺臟CXCL9和IL-15表達 RT-PCR結(jié)果顯示，IL-17D處理后，可顯著提高肺癌組織中CXCL9、IL-15等NK細胞募集功能相關(guān)因子的表達水平(P<0.05)，見圖4。

2.4黃芪上調(diào)肺臟IL-17D表達和NK細胞含量和抑制腫瘤肺臟轉(zhuǎn)移 流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，黃芪給藥處理后，實驗組小鼠較腫瘤模型對照組小鼠肺組織中的IL-17D及NK細胞數(shù)量明顯增多(P<0.05)，圖5A、B，肺臟B16黑色素瘤轉(zhuǎn)移灶的形成受到明顯抑制(P<0.01),見圖5C、D。

圖2 B16肺轉(zhuǎn)移模型中肺臟NK細胞含量顯著下降Fig.2 Decreased lung resident NK cells in lung with B16 melanoma metastasisNote: **.P<0.01.

圖3 IL-17D可增加肺臟NK細胞含量減少B16肺轉(zhuǎn)移克隆形成Fig.3 Up-regulation of lung resident NK cells and reduction of lung tumor foci after IL-17D nasal-treatment in B16 melanoma metasta-sis modelNote: **.P<0.01.

圖4 IL-17D上調(diào)肺臟CXCL9和IL-15的表達Fig.4 IL-17D promotes CXCL9 and IL-15 production in lung

圖5 中藥黃芪對肺臟IL-17D、NK細胞和B16肺轉(zhuǎn)移克隆形成的影響Fig.5 Effects of Astragalus (AG) on lung IL-17D production,proportion of NK cells and lung tumor fociNote: *.P<0.05，**.P<0.01.

3 討論

NK細胞具有免疫清除和免疫監(jiān)視的功能，可快速殺傷病毒感染細胞及腫瘤細胞，是機體天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分之一。NK細胞通過分泌IFN-γ、穿孔素、顆粒酶等細胞因子發(fā)揮強大的抗腫瘤效應(yīng)，并通過分泌多種細胞因子啟動獲得性免疫反應(yīng)，發(fā)揮多種抗感染免疫協(xié)同作用。NK細胞在體內(nèi)不同組織器官分布狀態(tài)不同，多依據(jù)局部組織中細胞因子或趨化因子微環(huán)境不同而不同。肺臟因常常應(yīng)對外界危險物質(zhì)的威脅,包括病原微生物、毒素、過敏原和塵埃的反復(fù)刺激，同時，又面臨突變細胞的轉(zhuǎn)移等各種危險，因此，需要大量的NK細胞發(fā)揮其抗炎抗腫瘤作用，主導(dǎo)或參與維持局部微環(huán)境的穩(wěn)定，這也使肺臟成為了NK細胞大量聚集的重要器官之一。NK細胞在肺臟免疫內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定中起著關(guān)鍵作用，也成為肺臟拮抗腫瘤轉(zhuǎn)移的主力細胞群體。肺臟局部駐留NK細胞的多少，直接決定肺臟免疫微環(huán)境的穩(wěn)定，特別是影響肺臟抗腫瘤形成的能力。肺臟局部NK細胞表型不同且功能各異[11]。具有抗腫瘤效應(yīng)的肺臟NK細胞高表達CXCR3，可與組織局部CXCL9、CXCL10、CXCL11等趨化因子相互作用，控制NK細胞肺臟駐留。同時，微環(huán)境中IL-15等細胞因子可維持NK細胞在局部募集并生存。這些細胞因子和趨化因子成為肺臟對NK細胞募集能力的重要標志，是肺臟NK細胞駐留的重要分子基礎(chǔ)，針對這些細胞因子，尋找調(diào)控他們并且與他們發(fā)生同步變化的細胞因子，可以獲得調(diào)控NK細胞肺臟募集能力的關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點，同時也將為改善并促進肺臟NK細胞抗炎抗腫瘤能力提供新的重要策略。

IL-17家族作為黏膜組織最敏感的感受器，其家族成員能趨化多種免疫細胞至炎癥灶或癌巢發(fā)揮抗炎、抗腫瘤效應(yīng)，IL-17家族作為多種細胞趨化的關(guān)鍵，其中多個家族成員的功能目前已被廣泛研究。但是關(guān)于IL-17D的功能調(diào)控，目前研究較少。已知IL-17D在肺臟和骨骼肌高表達，腫瘤細胞自身分泌的IL-17D可刺激腫瘤內(nèi)皮細胞招募NK細胞到腫瘤組織，并促進M1巨噬細胞的發(fā)育和抗腫瘤的適應(yīng)性免疫反應(yīng)[12]，但肺臟IL-17D對局部NK細胞募集能力的影響尚未見報道。

我們研究發(fā)現(xiàn)，肺臟局部IL-17D表達水平與肺臟NK細胞含量密切相關(guān)。在小鼠B16黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型中，IL-17D表達驟降，并且NK細胞含量顯著降低；進一步研究發(fā)現(xiàn)，在肺腫瘤中缺失的NK細胞，通過IL-17D經(jīng)鼻回補處理又回歸肺臟，并顯著抑制了肺轉(zhuǎn)移腫瘤克隆的形成，這一結(jié)果證明了IL-17D可以調(diào)控NK細胞在肺臟的募集。同時，黃芪上調(diào)肺臟IL-17D表達和NK細胞含量這一實驗也進一步證實了以上結(jié)論。

通過實驗，我們進一步證明了IL-17D可明顯上調(diào)CXCL9和IL-15表達，從而為NK細胞的肺臟募集創(chuàng)造了適宜的細胞因子微環(huán)境，從而使肺臟擁有足夠的NK細胞發(fā)揮抗腫瘤作用。IL-17D通過調(diào)控什么信號來左右趨化因子的表達從而影響NK細胞的募集和駐留，這一問題尚需進一步研究。

中醫(yī)中藥作為我國傳統(tǒng)智慧的結(jié)晶，成為抗腫瘤治療的關(guān)注焦點。近年來，許多學(xué)者在中醫(yī)藥與腫瘤免疫方面進行了廣泛而深入的研究，許多中藥材可通過增強或恢復(fù)癌癥患者免疫功能以達到抗腫瘤的目的。大量研究已證實：黃芪作為一味補益良藥具有補肺健脾、益腎脫毒之功效。研究表明黃芪及其有效成分可通過多種途徑調(diào)節(jié)機體免疫功能，同時具有抗病毒感染、抗腫瘤等作用[13,14]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芪中含量最多的有效成分黃芪多糖能促T淋巴細胞轉(zhuǎn)化、刺激 NK 細胞的細胞毒活性反應(yīng)[15]，同時還有抗衰老輻射、抗氧化應(yīng)激等作用[16]。研究表明黃芪單獨應(yīng)用具有一定的抗腫瘤作用，當與化療藥聯(lián)合用藥時具有增效解毒之益處[17]。

我們研究發(fā)現(xiàn)中藥黃芪補益肺氣的免疫藥理基礎(chǔ)之一就是提高肺臟局部組織IL-17D的表達，從而提高肺臟NK細胞的募集能力，進而抑制腫瘤的形成，從分子和細胞以及整體動物層面，明確了黃芪補益肺氣的組織特異性藥理藥效的免疫學(xué)基礎(chǔ)。同時也佐證了黃芪補肺氣的關(guān)鍵之一是上調(diào)IL-17D的表達，從而改變肺臟NK細胞的募集，發(fā)揮抗腫瘤作用。由此，圍繞IL-17D和NK細胞，我們明確了黃芪補益肺氣的部分免疫藥理學(xué)作用機制，拓展了傳統(tǒng)中藥黃芪的免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤藥用價值，再次確認了IL-17D在肺臟NK細胞募集效應(yīng)中的主導(dǎo)地位，也為腫瘤的中藥免疫治療提供了新的思路。

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