魯美鈺 仲維蘭 董萬法 姚慶收 司春楓 周 玲 徐茂磊

(濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 “方劑效應(yīng)與臨床評價”國家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)實驗室，煙臺 264003)

乳腺癌高居女性惡性腫瘤發(fā)病率的榜首，是影響女性生命健康的一大殺手[1]。伴隨著乳腺癌早期診斷率的提高及乳腺癌綜合治療技術(shù)的不斷進(jìn)步，乳腺癌患者的生存率有了明顯的提高，但仍有大約10%～15%的乳腺癌患者容易發(fā)生轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā),其中最常見的轉(zhuǎn)移部位為肺[2-4]。乳腺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是導(dǎo)致乳腺癌治療失敗的最主要原因，因此尋找有效的治療策略，預(yù)防乳腺癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是乳腺癌治療研究的熱點(diǎn)。

研究證實，在腫瘤形成及發(fā)展過程中會伴隨著大量新生血管的生成，這些新生血管為腫瘤的生長提供營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，并向遠(yuǎn)處輸送腫瘤細(xì)胞。腫瘤新生血管與腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移等特性密切相關(guān)，抗血管生成療法成為腫瘤生物治療的一個研究熱點(diǎn)[5-7]。在我們前期關(guān)于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)疫苗的研究中發(fā)現(xiàn)，以HUVEC作為抗原制備疫苗，經(jīng)主動免疫的方式可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生持續(xù)的靶向腫瘤新生血管的免疫反應(yīng)，達(dá)到了較好地控制腫瘤生長及轉(zhuǎn)移的作用，可以有效克服傳統(tǒng)抗血管生成藥物用藥昂貴、停藥后容易反跳及不良反應(yīng)嚴(yán)重的缺點(diǎn)[8,9]。

近年來多項臨床及臨床前研究證實抗血管生成藥物與小劑量化療聯(lián)合應(yīng)用能產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤作用[10]。多西紫杉醇(Docetaxel,DOC)作為治療乳腺癌的一線藥物，在臨床上已廣泛應(yīng)用，低劑量的DOC可以有助于打破機(jī)體對腫瘤的免疫耐受作用，增強(qiáng)疫苗誘導(dǎo)機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答。故而在本實驗中，我們將低劑量的DOC與HUVEC疫苗聯(lián)用，在小鼠EMT-6人工肺轉(zhuǎn)移模型中考察兩者聯(lián)合能否產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用，并探討協(xié)同抗腫瘤作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物與試劑 BALB/c小鼠，雌性，4～6周齡，購自濟(jì)南朋悅實驗動物繁育中心[許可證號：SCXK(魯)20130020]；多西紫杉醇(純度99%)購自上海薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司(批號：EE060142)；Cyto Tox 96?試劑盒購自美國Promega公司；IFN-γ檢測試劑盒購自美國Cloud-Clone公司；內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基ECM購自美國ScienCell公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清。購自杭州四季青生物工程材料研究所；細(xì)胞培養(yǎng)用青霉素鏈霉素混合液、ConA、蓖麻油聚氧乙烯醚(純度98%，級別GR)購自北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為市售(GR)。

1.1.2細(xì)胞株 HUVEC細(xì)胞購自美國ATCC細(xì)胞庫，于ECM內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基，5%CO2條件下培養(yǎng)。EMT-6小鼠乳腺癌細(xì)胞購自中國上海弘順生物科技有限公司，5%CO2條件下培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中。

1.2方法

1.2.1DOC及HUVEC疫苗的制備 蓖麻油聚氧乙烯醚與無水乙醇1∶1配成混合溶液，每毫升混合液中含有8 mg的DOC，用混合液將配好的溶液稀釋至2 mg/ml。收集3～5代HUVEC細(xì)胞，調(diào)整濃度至1×107ml-1。細(xì)胞離心后，取1 ml PBS溶解重懸細(xì)胞制成HUVEC疫苗。

1.2.2小鼠乳腺癌模型的建立 將BALB/c小鼠隨機(jī)分為：陰性對照組(PBS組)、疫苗組(HUVEC組)、多西紫杉醇組(DOC組)、聯(lián)合治療組(HUVEC-DOC組)4組，每組6只小鼠。將對數(shù)生長期的EMT-6細(xì)胞調(diào)整濃度至5×106ml-1，每只小鼠尾靜脈注射0.1 ml的腫瘤細(xì)胞懸液，建立EMT-6小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型。分別于荷瘤后的第1、6和12天，每只小鼠左肋部皮下注射相應(yīng)藥物，其中HUVEC組皮下注射HUVEC 疫苗100 μl，DOC組腹腔注射100 μl DOC、聯(lián)合治療組皮下注射100 μl的HUVEC疫苗并于腹腔注射100 μl DOC，陰性對照組通過皮下和腹腔各注射100 μl的PBS。建立模型后第21天處死所有小鼠，取肺，將肺組織于Bouin固定液(飽和苦味酸∶甲醛∶冰醋酸=75∶25∶5)中固定24 h，無水乙醇浸泡脫色，拍照，觀察肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量，并對肺組織切片進(jìn)行HE染色，觀察乳腺癌轉(zhuǎn)移情況。

1.2.3脾淋巴細(xì)胞增殖實驗 荷瘤后第21天處死小鼠，無菌取脾，將脾剪碎置于200目的篩網(wǎng)上，研磨過篩，制備脾細(xì)胞懸液，加紅細(xì)胞裂解液，洗滌3次，重懸細(xì)胞，將上述脾淋巴細(xì)胞懸液過70 μm尼龍網(wǎng)，富集T淋巴細(xì)胞，1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106ml-1，加入到96孔板中，每孔加入100 μl，同時各組加入空白培養(yǎng)基(PBS)為陰性對照組，5 mg/L的ConA(陽性對照組)，100 μg/ml的HUVEC裂解液(實驗組)。培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，每孔加入20 μl的MTT，繼續(xù)避光孵育3～4 h，最后每孔加入100 μl的二甲基亞砜，570 nm處測OD值。

1.2.4CTL實驗 荷瘤后第21天處死小鼠無菌取脾，研磨通過200目細(xì)胞篩，紅細(xì)胞裂解液裂解后，離心洗滌3遍，制備脾淋巴細(xì)胞懸液，1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，作為效應(yīng)細(xì)胞。收集HUVEC細(xì)胞，作為靶細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105ml-1。調(diào)整兩種細(xì)胞的濃度，按效靶比為200∶1、100∶1、50∶1、25∶1置于96孔尖板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)4 h，按試劑盒進(jìn)行操作，吸50 μl培養(yǎng)上清到96孔平板中，加入50 μl CytoTox 96試劑，避光室溫孵育30 min，最后每孔加入50 μl的終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀檢測490 nm處的OD值。釋放率(%)=(實驗組OD-效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)OD-靶細(xì)胞自發(fā)OD)/(靶細(xì)胞最大OD-靶細(xì)胞自發(fā)OD)×100% 。

1.2.5IFN-γ檢測 荷瘤后第21天處死小鼠無菌取脾，研磨通過200目細(xì)胞篩，紅細(xì)胞裂解液裂解后，離心洗滌3遍，制備脾淋巴細(xì)胞懸液，1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后取上清備用。實驗中使用IFN-γ 試劑盒進(jìn)行檢測，實驗試劑按說明書配制，設(shè)置空白孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔及樣品孔，每孔100 μl，均設(shè)置3個復(fù)孔。37℃孵育2 h。加檢測試劑A：孵育結(jié)束后棄去液體，不要洗板，每孔加入100 μl檢測試劑A，37℃孵育1 h，洗滌3次。每孔加入100 μl的檢測試劑B，再次洗滌，加顯色液(TMB)，37℃避光孵育15～25 min。加50 μl的終止液，酶標(biāo)儀測定450 nm 處的OD值。

2 結(jié)果

圖1 HUVEC疫苗聯(lián)合DOC協(xié)同抗EMT-6乳腺癌轉(zhuǎn)移作用小鼠肺臟轉(zhuǎn)移灶 B單位面積內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移灶數(shù)目Fig.1 Synergistic anti-metastasis effects of HUVEC vaccine combined with DOC in EMT-6 breast cancerNote:A.Lung metastasis in mice (Ⅰ.PBS；Ⅱ.HUVEC；Ⅲ.DOC；Ⅳ.HUVEC-DOC；Ⅴ.Healthy mouse)；B.The unit area numbers of metastasis.*.P<0.05,vs HUVEC group；**.P<0.01,vs DOC group.

2.1HUVEC疫苗聯(lián)合DOC協(xié)同抗乳腺癌轉(zhuǎn)移作用 為考察HUVEC-DOC聯(lián)合治療在治療性免疫中對腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用，建立了小鼠EMT-6乳腺癌人工肺轉(zhuǎn)移模型。實驗結(jié)果如圖1所示，與PBS組相比，各給藥組腫瘤轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目均有所減少，其中HUVEC-DOC聯(lián)合治療組肺臟腫瘤轉(zhuǎn)移灶數(shù)目最少，與HUVEC及DOC單藥組間差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01 vs HUVEC,P<0.05 vs DOC)。

2.2肺臟組織HE染色結(jié)果 為進(jìn)一步確定HUVEC-DOC聯(lián)合治療抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，對各組小鼠的肺臟進(jìn)行了病理組織學(xué)觀察。結(jié)果如圖2所示，PBS組、HUVEC疫苗組以及DOC化療藥物組均出現(xiàn)了不同程度的腫瘤細(xì)胞浸潤，而聯(lián)合治療組的肺組織結(jié)構(gòu)相對完整，腫瘤轉(zhuǎn)移灶數(shù)目最少，這進(jìn)一步說明HUVEC-DOC聯(lián)合治療顯示了良好的抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。

2.3淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng) 為考察HUVEC-DOC聯(lián)合治療引起的細(xì)胞免疫應(yīng)答水平，取不同處理組小鼠的脾臟進(jìn)行了脾淋巴細(xì)胞增殖實驗。實驗結(jié)果如圖3所示，與PBS組相比，HUVEC疫苗組和HUVEC-DOC聯(lián)合治療組小鼠的脾淋巴細(xì)胞對HUVEC抗原均能產(chǎn)生不同程度的增殖反應(yīng)，其中HUVEC-DOC組脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)更加明顯，與HUVEC組具有顯著性差異(P<0.05)，其刺激程度接近于ConA陽性對照組。

圖2 肺臟組織HE染色結(jié)果Fig.2 Histopathology study of lung tissuesNote:Ⅰ.PBS；Ⅱ.HUVEC；Ⅲ.DOC；Ⅳ.HUVEC-DOC.

圖3 脾淋巴細(xì)胞增殖實驗結(jié)果Fig.3 Effect of different administration on T lymphocytes proliferationNote:*.P<0.05,vs HUVEC group；**.P<0.01,vs DOC group.

圖4 細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞殺傷檢測Fig.4 Level of CTLs induced by different administrationNote:*.P<0.05,vs HUVEC group；**.P<0.01,vs model group.

圖5 IFN-γ的含量Fig.5 Content of IFN-γ Note:*.P<0.05,vs the HUVEC group；**.P<0.01,vs DOC group.

2.4CTL殺傷活性檢測 如圖4A所示，當(dāng)靶細(xì)胞為HUVEC細(xì)胞時，與PBS組相比，HUVEC和HUVEC-DOC組T淋巴細(xì)胞殺傷活性隨效靶比的上升而逐漸提高，其中HUVEC-DOC組最為顯著。當(dāng)效應(yīng)細(xì)胞為EMT-6小鼠乳腺癌細(xì)胞時，各組小鼠的T淋巴細(xì)胞均對EMT-6細(xì)胞沒有殺傷活性(圖4B)，這說明HUVEC-DOC聯(lián)合免疫誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答是HUVEC特異性的。

2.5IFN-γ含量 我們用ELISA法檢測了不同處理組小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ的含量，進(jìn)一步確證HUVEC-DOC聯(lián)合治療引起的細(xì)胞免疫應(yīng)答強(qiáng)度。如圖5所示，與PBS組相比，HUVEC和HUVEC-DOC組INF-γ含量都有不同程度的提高，其中HUVEC-DOC組INF-γ含量提高尤為明顯，較HUVEC組有顯著性差異(P<0.05)。

3 討論

侵襲及轉(zhuǎn)移是乳腺癌細(xì)胞重要的病理學(xué)特性，也是乳腺癌致死的重要原因，抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是治療乳腺癌的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的治療方法，如手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療針對惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的藥效都很局限。研究已證實腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移是血管依賴的，抑制腫瘤新生血管可以有效地抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。目前臨床應(yīng)用的抗血管生成藥物主要為單克隆抗體和小分子受體抑制劑，半衰期短、價格昂貴、毒副作用比較大等缺點(diǎn)，一定程度上限制了其在臨床上的應(yīng)用。隨著免疫學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，采用疫苗以主動免疫的方式免疫機(jī)體獲得持續(xù)的靶向腫瘤新生血管的免疫應(yīng)答，可以有效控制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，是對傳統(tǒng)抗血管生成治療方案的有益補(bǔ)充。

研究顯示持續(xù)小劑量的化療可以增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答水平，主動治療聯(lián)合小劑量化療能較徹底地殺傷腫瘤細(xì)胞，有效防止腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[11,12]。近年來研究中發(fā)現(xiàn)小劑量的DOC在腫瘤聯(lián)合治療方案中有較好的協(xié)同抗腫瘤作用[13,14]，在本實驗中，我們將低劑量DOC與前期研究的HUVEC疫苗聯(lián)用，期望可以進(jìn)一步提升HUVEC疫苗的抗腫瘤作用，并利用小鼠EMT-6人工肺轉(zhuǎn)移模型考察HUVEC-DOC聯(lián)合治療方案抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。實驗結(jié)果顯示：與HUVEC及DOC單藥組相比，HUVEC-DOC聯(lián)合治療組小鼠肺部腫瘤轉(zhuǎn)移灶明顯減少，這說明HUVEC疫苗與DOC聯(lián)用可起到協(xié)同抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖實驗、CTL殺傷實驗的結(jié)果顯示及IFN-γ含量測定實驗結(jié)果證實HUVEC-DOC聯(lián)合治療組的脾淋巴細(xì)胞增殖能力和CTL殺傷能力均顯著增強(qiáng)，IFN-γ含量也有一定程度的升高。以上結(jié)果說明低劑量的DOC與HUVEC疫苗聯(lián)用可以增強(qiáng)HUVEC疫苗引起的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答，這也是HUVEC-DOC聯(lián)合治療方案可以產(chǎn)生協(xié)同抗乳腺癌轉(zhuǎn)移的可能原因。

綜上所述，本研究證實低劑量的化療藥DOC與HUVEC疫苗聯(lián)用可以產(chǎn)生協(xié)同抗乳腺癌轉(zhuǎn)移的作用，DOC引入后可以增強(qiáng)HUVEC疫苗特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答，是該聯(lián)合治療方案可以產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用的原因，該實驗結(jié)果可以為臨床上抗乳腺癌轉(zhuǎn)移治療方案提供新思路。

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