郭紅雨 段永珂 何瑞利 程冠昌

(河南大學(xué)淮河醫(yī)院心內(nèi)科，開(kāi)封 475000)

心肌缺血是造成心臟病患者死亡的主要原因[1]，及時(shí)恢復(fù)心臟血液供應(yīng)是防治缺血損傷最有效的措施，然而缺血再灌注造成的心肌細(xì)胞損傷是亟待解決的問(wèn)題[2]。細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是心肌缺血再灌注損傷的重要病理基礎(chǔ)，細(xì)胞凋亡的數(shù)量決定了心肌缺血再灌注損傷的嚴(yán)重程度[3]。因此，闡明調(diào)控缺血再灌注導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制，對(duì)防治缺血再灌注損傷具有重要意義[4]。

肽基脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶1(Peptidyl-prolyl cis/trans isomerase,NIMA-interacting 1，Pin1)參與多條信號(hào)通路的調(diào)控，在心血管疾病發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用[5]，此外，Pin1在心肌肥大和心臟衰老中也具有重要作用[6-8]。研究報(bào)道Pin1可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9-11]。然而，Pin1蛋白在缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞中的作用未見(jiàn)報(bào)道，因此本文以大鼠H9c2細(xì)胞為對(duì)象，研究Pin1對(duì)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的作用。

1 材料與方法

1.1材料 大鼠胚胎H9c2心肌細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；TRIzol試劑盒和LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；兔抗大鼠Pin1抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司；兔抗大鼠Bcl-2抗體、兔抗大鼠Bax抗體和兔抗大鼠GAPDH抗體購(gòu)自中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；Pin1 siRNA(序列：TACGTCCAAGGTC-GGGCAGGAAGA)、scramble siRNA(序列：CAACCCGCTCCAAGGAATCG)均購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成有限公司；Pin1引物、GAPDH引物由上海生工生物工程有限公司合成，見(jiàn)表1。

1.2主要方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)進(jìn)行傳代。

1.2.2細(xì)胞分組及處理 將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、缺氧/復(fù)氧(H/R)組、Pin1 siRNA組、scramble siRNA(scramble)組?？瞻讓?duì)照組細(xì)胞在37℃、5%CO2和95%空氣的培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)；缺氧/復(fù)氧組細(xì)胞在無(wú)血清無(wú)糖的DMEM培養(yǎng)基，95%N2和5%CO2培養(yǎng)3 h后，于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，5%CO2和95%空氣中培養(yǎng)1 h[12]；Pin1 siRNA組轉(zhuǎn)染Pin1 siRNA 24 h后進(jìn)行缺氧/復(fù)氧處理；scramble組轉(zhuǎn)染非特異性siRNA后進(jìn)行缺氧/復(fù)氧處理。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞接種于6孔板，待匯合率達(dá)90%，用LipofectamineTM2000將100 nmol/L Pin1 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行缺氧/復(fù)氧處理。

表1引物序列

Tab.1Sequencesofprimers

NamePrimersequence(5′?3′)Product(bp)Pin1Forward：CCTAAAATGACTGGGAGGGGG125Reverse：TCCACTGCCCTTCTGAAGTCGAPDHForward：ACCACAGTCCATGCCATCAC419Reverse：TCCACCACCCTGTTGCTGTA

1.2.4MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2細(xì)胞接種于96孔板(3×104個(gè)/孔)，培養(yǎng)24 h后，每孔加20 μl MTT溶液(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去孔內(nèi)液體，加150 μl DMSO，搖床10 min充分溶解結(jié)晶物后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm的光吸收值A(chǔ)。細(xì)胞存活率(%)=(各組A490值/空白對(duì)照組A490值)×100%。

1.2.5Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡率和壞死率 培養(yǎng)并收集各組細(xì)胞，用冰PBS清洗后，加入500 μl Binding Buffer調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個(gè)/ml，分別加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，室溫避光反應(yīng)10 min，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

1.2.6Caspase-3活性的檢測(cè) 收集各組細(xì)胞，加入裂解液，冰浴裂解15 min，4℃、15 000 r/min離心5 min，10 μl，加入Ac-DEVD-pNA 10 μl，37℃孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定405 nm的光吸收值A(chǔ)405。樣品的A405扣除空白對(duì)照的A405為樣品中Caspase-3催化產(chǎn)生的pNA產(chǎn)生的吸光度。按照Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，測(cè)定并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)比計(jì)算出樣品中催化產(chǎn)生的pNA量計(jì)算Caspase-3活性。

1.2.7RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：95℃變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。

1.2.8Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 裂解細(xì)胞后，用BCA法定量，取20 μg蛋白樣品進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上，放入5%脫脂奶粉封閉1 h，加入兔抗大鼠Pin1抗體(1∶1 000)、Bcl-2抗體(1∶200)、Bax抗體(1∶200)、Caspase-3抗體(1∶500)4℃過(guò)夜。漂洗后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗(1∶3 000)孵育2 h。TBST漂洗后用ECL顯色觀察。

2 結(jié)果

2.1Pin1在缺氧/復(fù)氧H9c2細(xì)胞中表達(dá)升高 由圖1所示，和空白對(duì)照組相比，缺氧/復(fù)氧H9c2細(xì)胞中Pin1的mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高(PmRNA=0.000；P蛋白=0.003)。

2.2Pin1 siRNA轉(zhuǎn)染抑制Pin1表達(dá) 與對(duì)照組比，scramble siRNA組Pin1 mRNA和蛋白表達(dá)無(wú)顯著性差異(PmRNA=0.839；P蛋白=0.696)，Pin1 siRNA組Pin1的mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低(均P=0.000)，見(jiàn)圖2。

圖1 Pin1 RT-qPCR和Western blot檢測(cè)Pin1的表達(dá)Fig.1 RT-qPCR and Western blot detection for Pin1 expression(±s,n=3)Note:A.Pin1 mRNA expression;B.Pin1 protein expression.*.P<0.05,vs control group.

圖2 Pin1 siRNA轉(zhuǎn)染結(jié)果Fig.2 Pin1 siRNA transfection results (±s,n=3)Note:A.Pin1 mRNA expression;B.Pin1 protein expression.*.P<0.05 vs other groups.

圖3 Pin1 siRNA對(duì)細(xì)胞存活率的影響Fig.3 Effects of Pin1 siRNA on cell viability of H9c2 cells(±s，n=6)Note:#.P<0.05 vs control group;*.P<0.05 vs H/R group.

2.3Pin1 siRNA增加缺氧/復(fù)氧H9c2細(xì)胞存活率 MTT結(jié)果顯示，和對(duì)照組相比，缺氧/復(fù)氧組細(xì)胞的存活率顯著降低(P=0.000)；而Pin1 siRNA轉(zhuǎn)染后，缺氧/復(fù)氧H9c2細(xì)胞的存活率顯著增加(P=0.001)，見(jiàn)圖3。

2.4Pin1 siRNA對(duì)缺氧/復(fù)氧H9c2細(xì)胞凋亡和壞死的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，和對(duì)照組相比，缺氧/復(fù)氧組細(xì)胞凋亡率顯著增多(P=0.000)，壞死率無(wú)顯著差異(P=0.103)；Pin1 siRNA組的細(xì)胞凋亡率明顯少于缺氧/復(fù)氧組(P=0.000)，壞死率無(wú)顯著差異(P=0.789)，見(jiàn)圖4。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Pin1 siRNA對(duì)H9c2細(xì)胞凋亡率和壞死率的影響Fig.4 Effects of Pin1 siRNA on cell apoptotic rate (%) and necrotic rate (%) of H9c2 cells detected by flow cytometry(±s，n=3)Note:#.P<0.05 vs control group;*.P<0.05 vs H/R group.

圖5 Pin1 siRNA對(duì)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響n=3)Fig.5 Effects of Pin1 siRNA on protein expression of Bcl-2 and Bax(±s，n=3)Note:A.The protein expression of Bcl-2 and Bax；B.Comparison of Bcl-2/Bax.#.P<0.05 vs control group;*.P<0.05 vs H/R group.

圖6 Pin1 siRNA對(duì)Caspase-3活性影響Fig.6 Effects of siRNA on activity of Caspase-3(±s，n=6)Note:#.P<0.05 vs control group;*.P<0.05 vs H/R group.

2.5Pin1 siRNA對(duì)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的變化，結(jié)果如圖5所示。和對(duì)照組相比，缺氧/復(fù)氧組細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)降低、Bax表達(dá)增高，Bcl-2/Bax降低(均P=0.000)。和缺氧/復(fù)氧組相比，Pin1 siRNA組Bcl-2表達(dá)升高，Bax表達(dá)減少，Bcl-2/Bax升高(均P=0.000)。

2.6Pin1 siRNA抑制Caspase-3活性的影響 和對(duì)照組相比，缺氧/復(fù)氧組細(xì)胞Caspase-3活性增加(均P=0.000)。和缺氧/復(fù)氧組相比，Pin1 siRNA組細(xì)胞Caspase-3活性顯著降低(均P=0.000)，見(jiàn)圖6。

3 討論

Pin1是一個(gè)進(jìn)化上保守的肽基脯氨酰異構(gòu)酶，能夠特異性識(shí)別和結(jié)合特定的磷酸化蛋白，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而改變磷酸化蛋白質(zhì)的功能，影響細(xì)胞過(guò)程[13]。Pin1在調(diào)節(jié)心臟的病理生理過(guò)程中起著舉足輕重的作用[14]。研究表明，Pin1調(diào)控心肌肥厚信號(hào)[7]，可通過(guò)調(diào)節(jié)磷酸化分子的活性決定肥大心肌細(xì)胞的大小[6]。Pin1過(guò)表達(dá)可抑制心臟祖細(xì)胞衰老與死亡[8]，而抑制Pin1能夠減輕心肌纖維化和功能障礙[15]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模擬心臟缺血再灌注損傷，檢測(cè)Pin1對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的作用。結(jié)果表明，Pin1在缺氧/復(fù)氧大鼠心肌細(xì)胞高表達(dá)，提示Pin1可能在心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷中發(fā)揮重要作用。為進(jìn)一步探索Pin1對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷的影響，我們用Pin1 siRNA沉默Pin1的表達(dá)，檢測(cè)了Pin1 siRNA對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Pin1沉默能夠顯著增加缺氧/復(fù)氧H9c2細(xì)胞存活率，提示Pin1沉默可能對(duì)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷有重要的保護(hù)作用。由于只用了一種siRNA，不能排除脫靶效應(yīng)，但是圖2 中Pin1 siRNA轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示，和對(duì)照組及scramble siRNA組比較，Pin1表達(dá)下降了約75%，其功能性是可以保證的。

缺血再灌注可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡而使細(xì)胞死亡[16]。近年來(lái)，研究證實(shí)Pin1在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。Wang等[9]研究發(fā)現(xiàn)Pin1可調(diào)節(jié)高劑量酒精誘導(dǎo)的小鼠心肌細(xì)胞凋亡。另?yè)?jù)文獻(xiàn)報(bào)道Pin1沉默可抑制高氧誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡[17]。然而，Pin1是否參與缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡仍不明確，有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。本研究發(fā)現(xiàn)Pin1沉默能降低缺氧/復(fù)氧H9c2細(xì)胞凋亡率。Bax、Bcl-2和Caspase-3是線粒體凋亡信號(hào)通路中的下游分子[18]。Bcl-2家族是一種凋亡相關(guān)基因，通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[19]，其表達(dá)和調(diào)控是影響細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素[20]。Bcl-2調(diào)節(jié)開(kāi)啟線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔發(fā)揮抗凋亡作用，而B(niǎo)ax發(fā)揮促凋亡作用。Bcl-2/Bax的平衡影響凋亡的發(fā)生[21]。Caspase-3是Caspase依賴途徑中最終被主要激活的凋亡效應(yīng)酶，其活化在細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)過(guò)程中起著核心作用[22]，能夠水解多種重要的蛋白而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[23]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Pin1 siRNA能夠顯著上調(diào)Bcl-2表達(dá)，下調(diào)Bax，增加Bcl-2/Bax比值，降低Caspase-3活性，抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。

綜上，本研究在細(xì)胞水平證實(shí)，Pin1 siRNA可通過(guò)上調(diào)Bcl-2、下調(diào)Bax，降低Caspase-3活性，抑制了缺氧/復(fù)氧造成的心肌細(xì)胞凋亡，為基因治療缺血性心臟病提供了新的思路。

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