蒲小燕 胡方杰 李積東 劉 燕 喬麗娟 許玉珍 劉 珺 永 勝

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西寧 810001)

高原的自然環(huán)境較為特殊，其中較為明顯的自然環(huán)境是強(qiáng)輻射、低氧和寒冷。在高原環(huán)境下，隨著海拔的升高，空氣中的氧分壓不斷降低，機(jī)體長期處于缺氧環(huán)境中，嚴(yán)重者可出現(xiàn)低氧血癥。高原病是機(jī)體進(jìn)入高原地區(qū)后的常見病和特發(fā)病，低氧引起的高原病嚴(yán)重威脅著我國高原居民的健康。據(jù)研究報(bào)道，低氧可導(dǎo)致機(jī)體免疫功能下降，易感染，免疫細(xì)胞(如淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞)減少，T細(xì)胞增殖能力受損，而B細(xì)胞無明顯改變[1,2]。研究表明，模擬海拔8 000 m低氧暴露6 h后，小鼠脾臟CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞數(shù)均顯著下降[3]。目前，有關(guān)低氧對(duì)固有免疫細(xì)胞功能改變的報(bào)道甚少。本研究通過建立高原低氧環(huán)境的小鼠模型，研究低氧條件對(duì)巨噬細(xì)胞(Macrophages，Mφ)的功能改變及作用機(jī)制，為高原低氧對(duì)固有免疫功能的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性BALB/c小鼠，4～6周齡，體重(17±2)g，于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購買，動(dòng)物批準(zhǔn)號(hào)SCXK(陜2007-001)。

1.1.2儀器與試劑 恒溫?fù)u床(ZD-85，精達(dá)儀器制造有限公司) ；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Bio-Rad xMark，美國)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo Scientific Forma，美國)；小型臺(tái)式離心機(jī)(Eppendorf 5148R，德國)；流式細(xì)胞儀(BD FACS Calibur,美國)。異硫氰酸熒光素(FITC,eBioscience,美國)；雙乙?；葻晒馑?DCFH-DA,Sigma公司)； N-甲酞-甲硫氨酞-亮氨酞苯丙氨酸(fMLP,Sigma公司)；豆蔻酰佛波醇乙酷(PMA,Sigma公司)；脂多糖(LPS,Sigma公司)；RPMI1640、PBS 緩沖液(北京索萊寶公司)；IL-6、TNF-α、NO ELISA試劑盒(TSZ，美國)。

1.2方法

1.2.1高原低氧動(dòng)物模型的建立 30只健康雄性BALB/c小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，分3組。第1組為平原對(duì)照組，飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物試驗(yàn)中心30 d，海拔為400 m；第2組飼養(yǎng)于青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心動(dòng)物室30 d，海拔為2 200 m；第3組飼養(yǎng)于青海省果洛州甘德縣青珍鄉(xiāng)30 d，海拔為4 200 m。三個(gè)組小鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度均控制在18～20℃。

1.2.2檢測(cè)Mφ吞噬能力 小鼠腹腔Mφ的制備：小鼠脫頸處死，浸入75%酒精中5 min，腹腔注入5 ml PBS緩沖液，用棉球輕柔腹部1～2 min后吸取腹腔液置于離心管，1 500 r/min離心5 min，棄上清收集Mφ，臺(tái)盼藍(lán)染色證實(shí)細(xì)胞活率在95%以上，用RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml。于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種Mφ，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，用PBS洗去未貼壁細(xì)胞，收取貼壁腹腔Mφ，細(xì)胞濃度至1×106個(gè)/ml[4]。

FITC標(biāo)記細(xì)菌的制備：取對(duì)數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌，PBS液洗滌2次，懸浮于碳酸緩沖液(pH值為9.05)中，濃度調(diào)整至0.5×109個(gè)/ml，1 ml 菌液中添加50 mg/ml FITC 10 μl(終濃度為500 μg/ml)后，37℃ 恒溫?fù)u床培養(yǎng)3 h，用 RPMI1640 液清洗，懸浮于RPMI1640培養(yǎng)液(熒光標(biāo)記率為100%)。將細(xì)胞懸液與細(xì)菌懸液混合(細(xì)菌與細(xì)胞比例調(diào)整為20∶1)，37℃ 恒溫?fù)u床培養(yǎng)30 min，用2.5%的甲醛溶液固定30 min，懸浮于PBS液中(細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml)[4]。

吞噬能力檢測(cè)：用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Mφ吞噬率時(shí)，用陰性對(duì)照在 FSC 和 SSC 二維點(diǎn)陣圖選取 Mφ所在區(qū)域，調(diào)整 FS、SS 電壓，圈定門內(nèi)目的細(xì)胞。用FITC陽性細(xì)胞百分率來表示Mφ吞噬率，以陽性細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度(X-Mean)表示其吞噬指數(shù)，每個(gè)樣本均檢測(cè)10 000個(gè)細(xì)胞[4]。

1.2.3Mφ呼吸爆發(fā)檢測(cè) 裝載探針DCFH-DA：先將DCFH-DA(用無血清 RPMI1640培養(yǎng)液稀釋)加入至1×106個(gè)/ml Mφ細(xì)胞懸液中，將終濃度調(diào)為10 μmol/L。37℃、CO2培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育 30 min。每隔 3～5 min 顛倒混勻1次，使細(xì)胞和探針充分接觸，用PBS液洗滌細(xì)胞2次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的 DCFH-DA，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106個(gè)/ml[4]。

檢測(cè)呼吸爆發(fā)：用FL1直方圖陽性細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度(X-Mean)表示ROS水平[4](圖1)。各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分別添加fMLP (終濃度分別為0、0.1、1、10 μmol/L)及PMA(終濃度分別為0、0.1、1、10 μmol/L)后于37℃孵育fMLP組30 min、PMA組孵育60 min，每個(gè)樣本均檢測(cè)10 000 個(gè)細(xì)胞。

1.2.4檢測(cè)小鼠Mφ培養(yǎng)上清中的NO穩(wěn)定氧化代謝產(chǎn)物亞硝酸鹽(NO2-)水平 將1×106個(gè)/ml Mφ細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(100 μl/孔)，每孔添加100 μl LPS (終濃度分別為0、5、10、20、40 μg/ml) 刺激，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后獲取細(xì)胞培養(yǎng)上清，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作測(cè)定不同濃度LPS作用下細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO的濃度。

圖1 高原低氧對(duì)fMLP 和PMA誘導(dǎo)的小鼠腹腔Mφ 呼吸爆發(fā)功能的影響Fig.1 Effects of hypoxia on fMLP and PMA induced peritoneal macrophages respiratory burst in mice

1.2.5檢測(cè)小鼠Mφ培養(yǎng)上清中的IL-6、TNF-α的釋放水平 將1×106個(gè)/ml Mφ細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(100 μl/孔)，每孔加入100 μl LPS (終濃度為10 μg/ml)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-6、TNF-α的釋放水平。

2 結(jié)果

2.1高原低氧對(duì)Mφ吞噬能力變化的影響 海拔2 200 m和海拔4 200 m實(shí)驗(yàn)組小鼠Mφ的吞噬率及吞噬指數(shù)較平原對(duì)照組明顯降低(P<0.01)；海拔4 200 m 組小鼠Mφ吞噬率、吞噬指數(shù)較海拔2 200 m組明顯降低(P<0.01,表1，圖2)。

2.2高原低氧對(duì)Mφ呼吸爆發(fā)功能的影響 未添加刺激物(fMLP、PMA)時(shí)，海拔2 200 m組和海拔4 200 m 組Mφ的呼吸爆發(fā)水平與平原對(duì)照組相比較無明顯差異；添加刺激物(fMLP、PMA)后，海拔2 200 m 組和海拔4 200 m組Mφ的呼吸爆發(fā)水平在各濃度點(diǎn)上均低于平原對(duì)照組(P<0.01)；添加刺激物(fMLP、PMA)后，海拔4 200 m組Mφ的呼吸爆發(fā)水平明顯低于海拔2 200 m組(P<0.01,表2、3)。

GroupsnPhagocytosisrate(%)Phagocyticindex400m1072 1±4 7120 2±22 62200m1054 1±8 41) 97 4±9 61)4200m1042 6±5 91)2) 80 0±9 21)2)F102 735 4P<0 001<0 001

Note：1)P<0.01,compared with 400 m group;2)P<0.01,compared with 2 200 m group.

圖2 高原低氧對(duì)小鼠腹腔中Mφ吞噬能力的影響Fig.2 Effects of hypoxia on peritoneal macrophages phagocytosis in mice

2.3高原低氧對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠腹腔Mφ的NO產(chǎn)生的影響 未添加LPS時(shí)，海拔2 200 m和海拔4 200 m 組小鼠腹腔Mφ的NO釋放量明顯低于平原對(duì)照組 (P<0.01)，且海拔4 200 m組Mφ的NO釋放量明顯低于海拔2 200 m組(P<0.01)；添加LPS后，海拔2 200 m組和海拔4 200 m組小鼠腹腔Mφ培養(yǎng)上清中NO的濃度在各LPS濃度點(diǎn)上均低于平原對(duì)照組(P<0.01)；添加LPS后，海拔4 200 m組小鼠腹腔Mφ培養(yǎng)上清中NO的濃度明顯低于海拔2 200 m組(P<0.01，表4)。

2.4高原低氧對(duì)Mφ分泌IL-6、TNF-α的影響 未添加LPS時(shí)，海拔2 200 m和海拔4 200 m組小鼠腹腔Mφ培養(yǎng)上清中IL-6、TNF-α的濃度較平原對(duì)照組明顯升高(P<0.01)；海拔4 200 m組小鼠腹腔Mφ培養(yǎng)上清中IL-6、TNF-α的濃度較海拔2 200 m組明顯升高(P<0.01,表5)。添加LPS時(shí)，海拔2 200 m 組和海拔4 200 m組小鼠腹腔Mφ培養(yǎng)上清中IL-6、TNF-α的濃度明顯高于平原對(duì)照組(P<0.01)； 添加LPS后， 海拔4 200 m組小鼠腹腔Mφ培養(yǎng)上清中IL-6、TNF-α的濃度明顯高于海拔2 200 m組(P<0.01，表5)。

GroupsfMLP(μmol/L)00 1110400m73 3±4 791 4±3 9158 9±24 6240 4±31 82200m70 4±4 080 3±6 41)134 9±25 21)169 9±19 51)4200m69 6±4 470 6±6 71)2)88 2±6 71)2)128 3±15 11)2)F3 763 760 3119 2P0 03<0 001<0 001<0 001

Note：1)P<0.01,compared with 400 m group;2)P<0.01,compared with 2 200 m group.

GroupsPMA(μmol/L)00 1110400m73 3±4 7489 2±4 6669 3±5 8820 3±6 6 2200m70 4±4 0314 4±4 81)492 9±5 71)649 0±66 61)4200m69 6±4 4220 8±5 71)2)323 9±5 71)2)466 6±10 21)2)F3 714616 218082 3409 8P0 03<0 001<0 001<0 001

Note：1)P<0.01,compared with 400 m group;2)P<0.01,compared with 2 200 m group.

GroupsnLPS(μg/ml)05102040400m1017 0±1 020 7±1 826 4±1 431 7±1 937 0±1 32200m1013 8±2 21)17 7±1 31)20 3±1 31)22 2±1 51)25 5±1 01)4200m108 7±1 31)2)12 6±1 41)2)15 8±1 01)2)17 0±1 01)2)19 4±1 61)2)F55 159 0151 2191 7354 6P<0 001<0 001<0 001<0 001<0 001

Note：1)P<0.01,compared with 400 m group;2)P<0.01,compared with 2 200 m group.

GroupsnIL?6LPS(0μg/ml)LPS(10μg/ml)TNF?αLPS(0μg/ml)LPS(10μg/ml)400m1054 3±4 266 4±4 467 6±6 180 9±6 12200m1058 5±6 81)77 7±8 01)79 3±7 01) 122 1±17 31)4200m1080 9±6 11)2) 121 8±18 81)2)99 0±9 01)2) 161 4±10 51)2)F60 758 845 1108 6P<0 001<0 001<0 001<0 001

Note：1)P<0.01,compared with 400 m group;2)P<0.01,compared with 2 200 m group.

3 討論

Mφ是固有免疫中的重要成員，具有吞噬殺傷及抗原提呈的生物學(xué)功能，是維持機(jī)體正常生理狀態(tài)所必需的免疫細(xì)胞[5-7]。Mφ通過呼吸爆發(fā)功能得以清除吞噬溶酶體內(nèi)的病原微生物，是綜合性的機(jī)體防御性反應(yīng)。吞噬細(xì)胞可氧化還原型輔酶 Ⅱ (又稱煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，Nicotinamide adenine dinucl-eotide phosphate,NADPH)，繼而催化分子氧還原為反應(yīng)性氧中間產(chǎn)物(Reactive oxygen intermedi-ate,ROI)，伴有氧耗量驟然增加；ROI包括游離羥基(OH-)、超氧陰離子(O2-)、過氧化氫(H2O2)和單態(tài)氧(1O2)等活性氧(Reactive oxygen species,ROS)；這是一類高活性的殺菌物質(zhì)，這種現(xiàn)象稱呼吸爆發(fā)(Respiratory burst)[8]。NO是機(jī)體內(nèi)重要的效應(yīng)分子及信使分子，也是一種細(xì)胞毒分子，具有雙重作用[9,10]。NO具有非特異性殺菌和殺腫瘤作用，還可以在特異性淋巴細(xì)胞參與下發(fā)揮復(fù)雜的免疫功能。研究表明，高海拔低氧暴露條件下，增加機(jī)體的易感性，低氧可抑制單核/Mφ的遷移功能，低氧影響Mφ的吞噬能力，低氧抑制金黃色葡萄球菌的清除[11-15]。本研究結(jié)果也表明低氧可降低小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬率以及吞噬殺傷功能，與以往研究結(jié)果一致。此外，研究表明低氧抑制吞噬細(xì)胞 NADPH 氧化酶 PHOX 的活性[16]。Lewis等[17]的試驗(yàn)結(jié)果表明低氧刺激的巨噬細(xì)胞釋放NO的能力也有所下降。本研究結(jié)果也表明低氧可抑制巨噬細(xì)胞釋放NO的能力，與以往研究結(jié)果一致。據(jù)報(bào)道，激活Mφ分泌的IL-6、TNF-α炎性因子可引起廣泛的組織損傷、多器官炎癥反應(yīng)[18]。據(jù)研究報(bào)道，低氧能夠引起高原人群血清中IL-6、TNF-α水平上升[19]。本研究結(jié)果表明海拔2 200 m和4 200 m高原低氧暴露可促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-6、TNF-α的分泌功能，與以往研究結(jié)果一致。

綜上所述，海拔2 200 m和4 200 m高原低氧暴露可抑制小鼠腹腔Mφ吞噬及氧依賴殺傷功能、增加細(xì)胞因子的分泌造成組織損傷，進(jìn)而抑制小鼠Mφ的固有免疫功能。

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