易麗君 祝漫琴 周 菁 胡清華 黃 慧 陳 卡 江志軍 郭智彬

(江西省兒童醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，南昌 330006)

胸腺作為中樞免疫器官的一種，是胸腺依賴(lài)性淋巴細(xì)胞(Thymus-dependent lymphocyte，簡(jiǎn)稱(chēng)T細(xì)胞)分化發(fā)育的場(chǎng)所[1，2]。隨著我國(guó)老齡人口的不斷增長(zhǎng)，其健康水平受到越來(lái)越多的社會(huì)及政府關(guān)注。而老年人的免疫水平低下是老年病的重要誘因之一。特別是老年人胸腺的重量和結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著萎縮，外周免疫器官中成熟T細(xì)胞數(shù)量顯著降低，機(jī)體免疫功能受到嚴(yán)重影響。隨著年齡的增加，胸腺重量和體積明顯縮小，免疫功能減退的過(guò)程稱(chēng)為增齡性胸腺萎縮。胸腺由胸腺細(xì)胞與胸腺基質(zhì)細(xì)胞組成。胸腺細(xì)胞是處于不同分化階段的T細(xì)胞。胸腺基質(zhì)細(xì)胞是胸腺微環(huán)境的主要成分，包括胸腺上皮細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、成纖維細(xì)胞與巨噬細(xì)胞。已有文獻(xiàn)報(bào)道胸腺微環(huán)境中促進(jìn)T淋巴細(xì)胞發(fā)育的主要是胸腺上皮細(xì)胞[3,4]。國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的增齡性胸腺萎縮機(jī)理有兩種：①胸腺細(xì)胞功能受損，數(shù)量減少，直接影響胸腺細(xì)胞分化與成熟。②胸腺上皮細(xì)胞的數(shù)量減少，功能缺失，破壞了胸腺細(xì)胞發(fā)育的胸腺微環(huán)境，間接影響胸腺細(xì)胞分化與成熟。本課題組前期研究結(jié)果支持后者。

miRNA是一種22 bp左右的非編碼蛋白R(shí)NA，在真核細(xì)胞中miRNA通過(guò)結(jié)合特異序列影響相關(guān)靶基因的表達(dá)水平[5]。在胸腺的發(fā)育、衰老以及T細(xì)胞的成熟過(guò)程中已發(fā)現(xiàn)很多miRNA參與調(diào)節(jié)進(jìn)程。如miR-181a，參與了胸腺細(xì)胞分化與發(fā)育過(guò)程等[6]。目前為止，關(guān)于miR-194在胸腺增齡萎縮過(guò)程中的作用機(jī)制尚無(wú)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)檢測(cè)不同年齡組胸腺上皮細(xì)胞中miR-194與相應(yīng)靶基因表達(dá)水平并探討二者關(guān)系，闡述增齡性胸腺萎縮過(guò)程中的調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物分組與細(xì)胞提取 24只健康無(wú)疾病且無(wú)特定病原體(Specific pathogen free,SPF)級(jí)C57BL/6小鼠，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，每只體質(zhì)量25 g左右。中老齡小鼠均為自然老化。所有小鼠均在本實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)。小鼠按月齡分為4組：1月齡組、6月齡組、10月齡組和19月齡組，每組6只，雌雄各半。小鼠麻醉后，用眼科攝取出胸腺組織，置于無(wú)菌PBS液中，將胸腺囊膜輕輕撕裂并振蕩，釋放出T細(xì)胞。經(jīng)過(guò)CD45抗體磁珠分選法獲得胸腺上皮細(xì)胞。

1.2方法

1.2.1總RNA和反轉(zhuǎn)錄按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取各組胸腺上皮細(xì)胞總RNA。紫外分光光度儀檢測(cè)總RNA濃度及純度，瓊脂糖凝膠(1.5%)電泳檢測(cè)總RNA是否完整。取0.5 μg總RNA，利用SYBRTMPrime Script RT-PCR kit反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.2miRNA的提取、加尾與反轉(zhuǎn)錄參照miRNA 抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)提取各組胸腺細(xì)胞miRNA。核酸紫外分析儀檢測(cè)miRNA濃度及純度。參照Ecoli.Poly(A)聚合酶試劑盒將miRNA進(jìn)行加尾。取0.5 μg加尾后的miRNA，利用SYBR Prime ScriptTMRT-PCR kit反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄引物為：5-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATG-ACAGTG(T)24V-3′。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng) 反應(yīng)體積 20 μl(TaKaRa，Japan)：RNase Freed H2O 6 μl，2×SYBR PrimeScriptTM10 μl上下游引物2 μl，DNA模板(cDNA)2 μl，共計(jì)20 μl。在ABI7500中進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。miR-194上游引物序列：CATTCAACGCTGTCGGTGAGT；下游引物序列：GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG。PTPN12上游引物序列：TCCTGAGGAGGTTCATCCAGA；下游引物序列：CAGTGGCTGTGGGATAAATCTT。GAPDH上游引物序列：AGGTCGGTGTGAACGGATTTG；下游引物序列：GGGGTCGTTGATGGCAACA。miRNA內(nèi)參引物使用美國(guó) Ambion公司U6 snRNA。

1.2.4蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn) 從胸腺上皮細(xì)胞或OP9-DL1細(xì)胞中提取總蛋白并測(cè)定蛋白濃度。取總蛋白30 μg，經(jīng)10%SDS/PAGE分離膠電泳后轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂牛奶封閉，室溫靜置2 h。再經(jīng)過(guò)PTPN12抗體(1∶1 00)、β-actin抗體(1∶2 000)孵育，4℃過(guò)夜。然后TBST洗膜6次，5 min/次，加入辣根酶標(biāo)記IgG(稀釋)，室溫孵育60 min，TBST洗二抗3次。最后加入化學(xué)發(fā)光顯色液，暗室壓片，顯影和定影。使用Bio-Rad掃描儀掃描圖像，并用Image Lab進(jìn)行灰度值分析，將PTPN12與β-actin灰度值的比值作為蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 HEK293細(xì)胞購(gòu)買(mǎi)自南昌樂(lè)悠生物有限公司，DMEM高糖(HyClone)，10%FBS(HyClone)，37℃、5%CO2，過(guò)夜培養(yǎng)。OP9-DL1獲贈(zèng)于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，DMEM高糖(自配)，10%FBS(Gibco)，37℃、5%CO2，過(guò)夜培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：50 μl Opti-MEMI培養(yǎng)基稀釋0.8～1.0 μg DNA，50 μl Opti-MEMI培養(yǎng)基稀釋1 μl Lipofectamine 2000試劑?；旌舷♂尩腄NA和Lipofectamine 2000并直接將復(fù)合物加入到每孔細(xì)胞中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育24 h或48 h。

1.2.6熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 為驗(yàn)證 PTPN12是否為miR-194的靶基因，將插入PTPN12基因3′UTR片段(野生型或突變型)的熒光素酶報(bào)告載體與 miR-194 mimics(或miR-194 inhibitor)共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞中。所有熒光素酶報(bào)告載體、mimics與inhibitor均購(gòu)自廣州復(fù)能基因有限公司。分別于24 h、48 h后吸取細(xì)胞培養(yǎng)液。按試劑說(shuō)明書(shū)稀釋10倍GLS buffer母液至1倍工作液，避光室溫孵育25 min。加10 μl培養(yǎng)液至96孔板中再加入GLS buffer工作液100 μl，孵育1 min。取40～50 μl培養(yǎng)液，65℃孵育10～15 min，置于冰上。SEAP buffer中加入SEAP底物，室溫孵育5～10 min。加樣至96孔板中，開(kāi)始檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1不同月齡組胸腺上皮細(xì)胞內(nèi)PTPN12基因與miR-194表達(dá)水平 隨著月齡增長(zhǎng)，小鼠胸腺上皮細(xì)胞內(nèi)miR-194呈現(xiàn)表達(dá)下降趨勢(shì)(表1)，1月齡組與其他3組間均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。其中19月齡組小鼠胸腺上皮細(xì)胞內(nèi)miR-194表達(dá)下降趨勢(shì)最顯著，見(jiàn)圖1A。而PTPN12基因mRNA表達(dá)水平則明顯呈現(xiàn)上升趨勢(shì)(表1)，1月齡與其他3組間均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。其中19月齡組小鼠胸腺上皮細(xì)胞內(nèi) PTPN12表達(dá)上升趨勢(shì)最顯著，見(jiàn)圖1B。

表1不同月齡小鼠胸腺上皮細(xì)胞內(nèi)miR-194、PTPN12表達(dá)水平變化

Tab.1ExpressionofmiR-194andPTPN12inthymusepi-thelialcellsfromdifferentmonthsofmouse

與mRNA結(jié)果一致的是，PTPN12的蛋白表達(dá)水平也呈現(xiàn)上升趨勢(shì)(表1)， 1月齡組與其他3組間均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見(jiàn)圖1D、E。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，小鼠胸腺上皮細(xì)胞內(nèi)miR-194與PTPN12基因mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.80，P<0.05)，見(jiàn)圖1C。

2.2熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 分別轉(zhuǎn)染miR-194 mimics或 inhibitor 24 h后檢測(cè)熒光值，詳見(jiàn)表2。結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)miR-194 后，PTPN12基因3′UTR野生型組熒光值顯著降低約50%，與突變組、空質(zhì)粒組(NC)、亂序組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。而PTPN12基因3′UTR位點(diǎn)突變后與miR-194的結(jié)合效率明顯下降，與空白質(zhì)粒組及Scramble 1組三組熒光值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。該結(jié)果直接證實(shí)PTPN12基因是miR-194靶基因之一。

表2分別轉(zhuǎn)染miR-194mimics或inhibitor24h后結(jié)果

Tab.2ResultoftransfectionofmiR-194mimicsorinhibi-torintocellsafter24h

GroupsmiR?194mimicsScramble1miR?194inhibitorScramble2PTPN12wildtype1 06±0 061 83±0 072 14±0 101 80±0 05PTPN12mutanttype1 83±0 041 96±0 072 03±0 051 88±0 04Negativecontrol2 08±0 011 95±0 071 94±0 061 89±0 06

圖1 miR-194與PTPN12基因的表達(dá)水平及相關(guān)性分析Fig.1 Expression level and correlation analysis of miR-194 and PTPN12 geneNote:A.miR-194 expression level;B.PTPN12 mRNA expression level;C.Correlation analysis between miR-194 and PTPN12 mRNA expression;D.PTPN12 protein expression level(Western blot);E.PTPN12 protein expression level (statistics).

表3分別轉(zhuǎn)染miR-194mimics或inhibitor48h后結(jié)果

Tab.3ResultoftransfectionofmiR-194mimicsorinhi-bitorintocellsafter48h

GroupsmiR?194mimicsScramble1miR?194inhibitorScramble2PTPN12wild1 22±0 132 66±0 153 02±0 212 76±0 14PTPN12mutants2 74±0 262 85±0 222 88±0 163 01±0 20Negativecontrol2 97±0 212 96±0 183 00±0 202 91±0 20

表4轉(zhuǎn)染miR-194mimic48h后檢測(cè)PTPN12表達(dá)水平

Tab.4ExpressionlevelofPTPN12withmiR-194mimictransfectionintocellsafter48h

GroupsmiR?194PTPN12mRNAPTPN12proteinNegativecontrol1 06±0 161 08±0 131 13±0 18Scramble10 98±0 121 15±0 161 12±0 11miR?194mimics2 78±0 330 40±0 090 48±0 13

圖2 轉(zhuǎn)染miR-194 mimic 48 h后PTPN12基因的表達(dá)水平及相關(guān)性分析Fig.2 Expression level and correlation analysis of miR-194 and PTPN12 with miR-194 mimic transfection into cells after 48 hNote:A.miR-194 and PTPN12 mRNA expression level;B.PTPN12 protein expression level (Western blot);C.PTPN12 protein expression level (statistics).

結(jié)果還顯示沉默miR-194 后，PTPN12基因3′UTR野生型組熒光值比突變組稍高，雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但說(shuō)明少量?jī)?nèi)源性miR-194對(duì)PTPN12基因3′UTR有影響，間接證實(shí)PTPN12基因是miR-194靶基因之一。

再次觀察轉(zhuǎn)染miR-194 mimics或 inhibitor 48 h后的熒光值，詳見(jiàn)表3。結(jié)果與24 h相似，但共轉(zhuǎn)染miR-194 與PTPN12基因3′UTR野生型組熒光值降低約60%，比24 h下降程度更明顯，因此觀察時(shí)間上48 h比24 h更合適，二者結(jié)合效率更高。該結(jié)果同樣直接證實(shí)PTPN12基因是miR-194靶基因之一。

2.3過(guò)表達(dá)miR-194后，細(xì)胞內(nèi)PTPN12基因表達(dá)水平變化 取指數(shù)生長(zhǎng)期的OP9-DL1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染miR-194 mimic，48 h后檢測(cè)PTPN12表達(dá)水平變化。結(jié)果(表4)顯示：轉(zhuǎn)染Scramble1組與未轉(zhuǎn)染組(NC)之間miR-194表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而轉(zhuǎn)染miR-194 mimics組比其他兩組miR-194表達(dá)水平明顯升高且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功。而過(guò)表達(dá)miR-194的OP9-DL1細(xì)胞內(nèi)PTPN12基因的mRNA與蛋白水平顯著下降(圖2)，說(shuō)明miR-194確實(shí)影響了PTPN12基因的表達(dá)水平。再次證實(shí)PTPN12基因是miR-194靶基因之一。

3 討論

人體免疫系統(tǒng)是由相應(yīng)的免疫器官、組織、細(xì)胞及分子構(gòu)成。免疫器官包括中樞與外周免疫器官。骨髓作為中樞免疫器官之一，是所有免疫細(xì)胞的產(chǎn)生地，也是B細(xì)胞發(fā)育的場(chǎng)所。胸腺則是T細(xì)胞分化發(fā)育的場(chǎng)所。

近年來(lái)越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，增齡性胸腺萎縮是老年人機(jī)體免疫功能下降的主要原因之一，但其分子機(jī)制尚不明確。目前，國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的增齡性胸腺萎縮機(jī)制假說(shuō)有兩種：①T淋巴祖細(xì)胞本身功能受損，數(shù)量減少，導(dǎo)致胸腺發(fā)生萎縮。②胸腺上皮細(xì)胞數(shù)量減少，功能退化，數(shù)量減少，T細(xì)胞的發(fā)育微環(huán)境被破壞，影響T細(xì)胞的分化與成熟。本研究認(rèn)為后者是主要原因。國(guó)內(nèi)外已有文獻(xiàn)報(bào)道參與胸腺發(fā)育與衰老的基因，如Foxn1、Hoxa3、Wnt4等[7]。在增齡性胸腺萎縮過(guò)程中，這些基因與miRNA構(gòu)成了非常復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)并發(fā)揮作用。

miRNA是一種22 bp左右的非編碼蛋白R(shí)NA，它的前體中包含發(fā)夾結(jié)構(gòu)。Dicer酶將miRNA前體剪切成為成熟的miRNA序列，參與到RISC復(fù)合體中起降解mRNA或阻斷mRNA翻譯的過(guò)程。

本課題組在前期研究工作中將不同年齡組小鼠胸腺上皮細(xì)胞進(jìn)行miRNA表達(dá)譜篩選，并進(jìn)行了Real-time PCR驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)了與增齡性胸腺萎縮密切相關(guān)的20種miRNA[8]。其中，miR-194是隨年齡增長(zhǎng)，胸腺上皮細(xì)胞中表達(dá)差異非常明顯的miRNA之一。而miR-194的靶基因鑒定及基因功能等后續(xù)研究工作尚未展開(kāi)。已有文獻(xiàn)報(bào)道，miR-194靶基因有很多，且作用機(jī)制各異。如miR-194通過(guò)下調(diào)STAT1促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[9]，或靶定RBX1調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的增殖與遷移[10]，或靶定細(xì)胞骨架蛋白talin2抑制了腫瘤細(xì)胞的遷移[11]等。Khella等[12]還發(fā)現(xiàn)在腎細(xì)胞癌中miR-194靶定ZEB2、MDM2抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展。Wu等[13]在肺癌中發(fā)現(xiàn)，miR-194靶定BMP1和p27來(lái)調(diào)控TGF-β信號(hào)通路，進(jìn)而下調(diào)MMP2和MMP9基因。Zhai等[14]發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜癌患者中，miR-194高表達(dá)的患者預(yù)后較好。然而，Zhang等[15]在小鼠胰管癌中發(fā)現(xiàn)miR-194靶定DACH1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖與侵襲，是一種腫瘤促進(jìn)因子。Iizuka等[16]也認(rèn)為miR-194靶定NUDC和DEPDC1B基因促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖。目前已發(fā)現(xiàn)的miR-194靶基因還有Tcf1、ACVR2B、Sox5等[17-19]。由此可見(jiàn)，在腫瘤學(xué)中miR-194的靶基因及相關(guān)調(diào)控機(jī)制研究較多。但在免疫學(xué)，特別是增齡性胸腺萎縮發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中miR-194的靶基因及調(diào)控的下游信號(hào)通路尚未發(fā)現(xiàn)，其分子調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確。

在本課題組前期研究工作中，通過(guò)microRNA靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)到miR-194的靶基因有：PTPN12、Hbegf和Sumo2。PTPN12，1993年被首次克隆出來(lái)，是一種非跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶[20]。2004年Hasegawa等[21]發(fā)現(xiàn)PTPN12基因調(diào)節(jié)T細(xì)胞發(fā)育與分化，影響效應(yīng)/記憶T細(xì)胞的功能，參與免疫反應(yīng)。最近的研究發(fā)現(xiàn)PTPN12與AKT通路或NF-kappaB通路相關(guān)，影響T細(xì)胞受體的先天性免疫[22-24]。目前為止，PTPN12的細(xì)胞生物學(xué)功能主要是抑制細(xì)胞增殖或促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但是腫瘤學(xué)功能尚不明確。雖然在大部分腫瘤研究中普遍認(rèn)為PTPN12是一種腫瘤抑制基因，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖與遷移或者被甲基化沉默[25,26]。但是Harris等[27]卻發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中PTPN12是一種腫瘤促進(jìn)因子，與FOXO信號(hào)通路有關(guān)。綜上所述，PTPN12是增齡性胸腺萎縮研究中miR-194未知的靶基因之一。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著年齡增長(zhǎng)，小鼠胸腺上皮細(xì)胞內(nèi)PTPN12 基因表達(dá)明顯呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，與 miR-194 的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。通過(guò)熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-194 的靶基因之一是PTPN12，并通過(guò)多組對(duì)照反向證實(shí)該結(jié)果。在細(xì)胞中改變miR-194表達(dá)水平時(shí)，PTPN12表達(dá)水平亦發(fā)生相應(yīng)變化。表明 miR-194 有極大可能是通過(guò)靶向調(diào)節(jié) PTPN12 基因，參與增齡性胸腺萎縮過(guò)程，為研究增齡性胸腺萎縮的分子機(jī)制提供新的研究方向。綜上所述，PTPN12是miR-194的靶基因之一，有極大可能調(diào)控胸腺上皮細(xì)胞功能，參與增齡性胸腺萎縮過(guò)程。為進(jìn)一步闡明增齡性胸腺萎縮過(guò)程中的基因調(diào)節(jié)機(jī)制，也為提高老年人健康生活水平提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

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