唐永梅，韋繼紅，梁明明，韋立紅

(廣西柳州市婦幼保健院，廣西 柳州 545001)

自1992年P(guān)alermo等[1]利用卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(ICSI)輔助授精獲得成功妊娠后，ICSI技術(shù)在臨床中廣泛地應(yīng)用于因男性因素如嚴(yán)重少弱畸形精子癥、梗阻性和一些非梗阻性無(wú)精子癥而引發(fā)的不孕癥治療，也成為常規(guī)體外受精(IVF)失敗、不成熟卵體外培養(yǎng)和凍融卵母細(xì)胞、植入前遺傳學(xué)診斷等常規(guī)受精技術(shù)。ICSI是逾越了精子功能直接進(jìn)入卵母細(xì)胞漿內(nèi)的一系列復(fù)雜過(guò)程，受精形成胚胎后移植可獲得妊娠，是最主要的常規(guī)輔助生殖技術(shù)之一。根據(jù)Payne和Flaherty的回顧分析，采用ICSI仍然有30%的卵母細(xì)胞不受精，其原因可能是因?yàn)槁涯讣?xì)胞未能激活，因?yàn)橹荒苁咕舆M(jìn)入卵母細(xì)胞，但精子若不能激活卵子，使第二極體排出、DNA去緊密化、原核的形成等后序變化不能完成，則會(huì)造成受精失敗，即ICSI替代常規(guī)IVF不一定能避免受精失敗的發(fā)生，ICSI的完全受精失敗發(fā)生率為2%～3%[2]。對(duì)于ICSI受精失敗的對(duì)策是行人工輔助激活(AOA)。本研究通過(guò)對(duì)有前次ICSI受精率低的周期或通過(guò)ICSI后的早期觀察，在再次ICSI周期中或通過(guò)高危周期ICSI后的早期觀察，對(duì)不受精的卵母細(xì)胞進(jìn)行人工激活，探討早期觀察后聯(lián)合AOA在體外受精中的應(yīng)用價(jià)值，為分析ICSI失敗病例的后續(xù)治療提供依據(jù)。

1 臨床資料

1.1研究對(duì)象 選擇2013年1月—2016年7月在本生殖中心接受ICSI治療中，前次ICSI受精失敗(完全不受精和受精率低于30%)、圓頭精子癥、死精癥及形態(tài)畸形嚴(yán)重或手術(shù)取精精子嚴(yán)重畸形的60例(共61個(gè)治療周期)患者作為研究組，其中前次ICIS受精失敗或低下25例，手術(shù)取精I(xiàn)CSI 15例，死精2例，嚴(yán)重畸形精子癥18例。以同期的23例(23個(gè)常規(guī)ICSI周期)受精正常未行激活患者作為對(duì)照組。2組一般資料見(jiàn)表1。所有早期觀察行AOA激活前簽署經(jīng)柳州市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)討論通過(guò)的知情同意書(shū)。

表1 2組一般資料比較

1.2臨床促排卵方案及授精 根據(jù)患者年齡、卵巢儲(chǔ)備功能等進(jìn)行個(gè)體化治療，主要有促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑+促性腺激素(GnRHa+Gn)長(zhǎng)方案、短方案及微刺激方案。促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(GnRH-a)長(zhǎng)方案： 于前次月經(jīng)第21—23天肌內(nèi)注射達(dá)菲林0.1 mg/d(醋酸曲普瑞林，法國(guó)，益普生)，15～20 d后根據(jù)患者年齡、竇卵泡數(shù)、基礎(chǔ)性激素及以往卵巢反應(yīng)情況選用1～4支基因重組促卵泡激素(FSH，果納芬，瑞士雪蘭諾，75 IU/支)/人絕經(jīng)期尿促性腺激素(HMG，珠海麗珠)啟動(dòng)。此后根據(jù)卵泡大小及激素變化調(diào)整Gn用量。扳機(jī)時(shí)機(jī)為>18 mm卵泡直徑占50%以上時(shí)，注射達(dá)菲林或4 000～10 000 IU HCG 34～36 h后經(jīng)陰道B超介導(dǎo)取卵，精液經(jīng)梯度離心處理，取卵后2～3 h用透明質(zhì)酸酶消化去除顆粒細(xì)胞，注射HCG后39～40 h對(duì)MII卵采用ICSI方法授精。

1.3早期受精的判斷及輔助激活方法 早期觀察是在ICSI后3～5 h后觀察第二極體釋放情況來(lái)判斷是否受精，如果觀察時(shí)間內(nèi)卵子未排出第二極體，則判斷為不受精。 輔助激活是將未釋放第二極體的卵母細(xì)胞置于10 μmol/L離子霉素中37 ℃孵育5～10 min后充分洗滌再繼續(xù)培養(yǎng)。機(jī)械法激活為ICSI時(shí)利用抽吸卵胞漿的機(jī)械刺激達(dá)到激活目的。

1.4原核觀察和胚胎移植 激活后16～18 h進(jìn)行原核評(píng)估，可見(jiàn)到2個(gè)清晰獨(dú)立的原核為正常受精卵。根據(jù)卵裂球分裂速度、數(shù)目、大小均勻、對(duì)稱(chēng)性及胞質(zhì)、碎片比例等情況進(jìn)行第3天(D3)胚胎質(zhì)量評(píng)估[3]，予移植或囊胚培養(yǎng)后移植囊胚或?qū)衫门咛ミM(jìn)行冷凍保存。若部分ICSI受精則優(yōu)先選擇未經(jīng)激活2PN受精的優(yōu)質(zhì)胚胎在超聲引導(dǎo)下進(jìn)行胚胎移植。移植后給予黃體酮60 mg/d 肌注進(jìn)行黃體支持。移植后4周行陰道超聲檢查發(fā)現(xiàn)宮腔孕囊為臨床妊娠。

2 結(jié) 果

2.1受精情況 對(duì)照組ICSI受精率為75.2%(137/182)。研究組前次ICSI受精失敗再次ICSI受精失敗或低下發(fā)生率(完全不受精和受精率低于30%)為36.0%(9/25)，AOA前受精率僅38.0%(35/92)，未受精MII(未排出第二極體)AOA完全不受精組受精率為62.5%(36/56)，不完全受精失敗組受精率為55.2%(16/29)，總受精率為77.2%(71/92)；嚴(yán)重圓頭畸形精子癥當(dāng)次ICSI受精失敗或低下發(fā)生率為38.9%(7/18)，AOA前受精率為15.9%(7/44)，AOA激活受精率為66.7%(18/27)，總受精率為56.8%(25/44)；死精2例ICSI均未受精，AOA激活受精率為26.3%(5/19)。手術(shù)取精I(xiàn)CSI受精失敗發(fā)生率為26.7%(4/15)；AOA前受精率為50.6%(79/156)，AOA受精率為70.0%(35/50),總受精率為73.0%(112/156)。ICSI-AOA對(duì)于由于精子缺乏激活因子而導(dǎo)致受精障礙患者，激活后受精率都得到明顯提高。

2.2不同激活時(shí)間對(duì)激活效率的影響 對(duì)照組總受精率、卵裂率、優(yōu)胚率及囊胚形成率分別為75.2%，97.7%，34.8%，44.0%。研究組ICSI MII卵580個(gè)，通過(guò)機(jī)械法激活受精率為55.2%(320/580)；對(duì)未排出第二極體中的176個(gè)卵子行離子霉素激活，AOA受精率為68.2%(120/176),其中3 h與5 h激活的受精率、優(yōu)胚率和囊胚形成率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，18 h激活效率最低，與3 h、5 h比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同激活時(shí)間激活效率及胚胎發(fā)育情況

注：①與對(duì)照組比較，P<0.05；②與研究組18 h比較，P<0.05；③與研究組5 h比較，P<0.05。

2.3臨床結(jié)局 61個(gè)周期ICSI-AOA周期完全移植激活胚胎的有14個(gè)移植周期，臨床妊娠6個(gè)周期，臨床妊娠率42.9%。首例AOA胎兒已成功分娩2個(gè)健康嬰兒，1例發(fā)生早期流產(chǎn)，余4例處于繼續(xù)妊娠中。

3 討 論

ICSI是借助顯微注射儀直接將精子注射到卵胞漿內(nèi)，繞過(guò)了常規(guī)IVF精子與卵透明帶的結(jié)合、頂體反應(yīng)、精子與卵細(xì)胞膜的融合等來(lái)實(shí)現(xiàn)受精的過(guò)程。卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射的刺激主要來(lái)自兩方面：一是注射針的機(jī)械刺激，因此注射精子后適當(dāng)?shù)貙?duì)卵母細(xì)胞胞質(zhì)進(jìn)行抽吸就顯得很有必要；二是注入精子的生物刺激，精子進(jìn)入后也會(huì)發(fā)生一系列的生物反應(yīng)，進(jìn)而刺激卵母細(xì)胞激活。針刺進(jìn)入卵母細(xì)胞后會(huì)誘發(fā)單個(gè)Ca2+波動(dòng)，輕微升高培養(yǎng)液中的Ca2+濃度，但對(duì)卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射不產(chǎn)生明顯影響，精子注入卵子后，卵母細(xì)胞的酶可以修飾精子膜，釋放一種“鈣振素”使卵子活化，三磷酸肌醇(IP3)和其他第二信使系統(tǒng)被激活。發(fā)生卵母細(xì)胞激活失敗可能是由于注射時(shí)用力過(guò)大，導(dǎo)致卵母細(xì)胞胞質(zhì)結(jié)構(gòu)改變而使卵母細(xì)胞死亡；還有可能是未對(duì)精子進(jìn)行適當(dāng)?shù)剡x擇，注射的精子是形態(tài)不規(guī)則或者死亡的精子，因?yàn)槠淙狈δ撤N因子或相關(guān)因子生物活性缺乏而使卵母細(xì)胞未被激活導(dǎo)致卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射受精失敗。本研究組為ICSI受精失敗的高危群體，受精失敗率37.7%(23/61)，遠(yuǎn)高于相關(guān)報(bào)道的2%～3%[2]。對(duì)于ICSI受精失敗患者可以借助AOA，即通過(guò)物理或化學(xué)的方法使卵子胞漿內(nèi)產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)鈣脈沖信號(hào)，誘導(dǎo)卵子完成減數(shù)分裂可以有效地克服因卵母細(xì)胞激活不足引起的受精失敗或受精率低，并能獲得正常發(fā)育的胚胎。AOA方法包括機(jī)械刺激(即改良的卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射法：在常規(guī)卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射將精子注入卵子質(zhì)膜時(shí)用比較強(qiáng)烈地抽吸胞漿并反復(fù)幾次)、物理方法(電誘導(dǎo)活化卵子)、化學(xué)方法(用化學(xué)試劑如乙醇、Ca2+載體、氯化鍶、即用型鈣離子溶液等激活卵子)以及蛋白質(zhì)合成抑制劑和蛋白磷酸化抑制劑應(yīng)用等[3-7]。目前常用卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射后的卵子放入Ca2+載體A23817或離子霉素中孵育5～10 min，后轉(zhuǎn)入標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

有研究報(bào)道行輔助激活選擇ICSI后0.5～24 h[7-8]均可以受精并獲得胚胎。何時(shí)是行輔助激活的最佳時(shí)機(jī)呢？有作者研究第二極體排除的時(shí)間，在精卵共培養(yǎng)后2 h排出率為39%，4 h為78%，6 h為94%，還有6%～7%在8～18 h才排出[9]，本研究也通過(guò)延時(shí)攝像技術(shù)觀察了ICSI后第二極體排出的時(shí)間及比例，認(rèn)為5 h在極體排出率近100%的情況下再對(duì)無(wú)第二極體排出的卵母細(xì)胞行輔助激活的時(shí)機(jī)時(shí)最安全有效的，可以獲得滿意的受精率、優(yōu)胚率和囊胚形成率。3 h與5 h效果相似，但有過(guò)度操作的風(fēng)險(xiǎn)。3～5 h應(yīng)根據(jù)患者實(shí)際情況，如對(duì)于完全I(xiàn)CSI受精障礙的患者采用3 h，部分障礙的患者采用5 h的激活方法。本研究對(duì)前次ICSI受精受精失敗史行早期觀察16例中，發(fā)生再次受精障礙率為37.5%，大多數(shù)周期不需要輔助化學(xué)激活。在圓頭精子癥中，ICSI后行化學(xué)激活是必要的，研究還發(fā)現(xiàn)，死精癥ICSI及AOA效果差，對(duì)于這類(lèi)患者通過(guò)行睪丸穿刺獲取精子可達(dá)到改善受精結(jié)局的目的。18 h后AOA激活效果差，可能與卵子老化有關(guān)。對(duì)于有ICSI受精障礙高危因素的周期實(shí)行早期觀察后，用離子霉素AOA是有效的補(bǔ)救措施。關(guān)于AOA嬰兒出生的安全性，Vanden等[10]報(bào)道利用輔助卵母細(xì)胞激活技術(shù)可以成功獲得健康的嬰兒，且發(fā)育正常。2015年，Karaca等[11]研究人員利用鈣離子載體激活卵母細(xì)胞并成果獲得健康胎兒分娩。Eindhoven等[12]也報(bào)道，通過(guò)輔助卵母細(xì)胞激活技術(shù)出生的嬰兒與正常分娩的嬰兒發(fā)育未出現(xiàn)顯著差異。從原理上來(lái)說(shuō)，AOA主要解決由于精子缺乏激活能力而導(dǎo)致的受精失敗，而對(duì)于單純卵母細(xì)胞因素導(dǎo)致的受精失敗，效率較低。目前卵母細(xì)胞輔助激活的應(yīng)用范圍：精子缺乏PLCζ(例如100%圓頭精子癥)；嚴(yán)重的畸形精子癥；既往ICSI受精失敗或受精率低下；睪丸活檢精子等。而卵源性的ICSI障礙效果不佳。

由于鈣離子載體的化學(xué)活性很強(qiáng)，可能會(huì)誘導(dǎo)受精卵基因突變，其對(duì)胚胎發(fā)育的安全性完全沒(méi)有明確，故持謹(jǐn)慎的態(tài)度。后期繼續(xù)加大樣本量，以便獲得更可靠的數(shù)據(jù)，安全應(yīng)用該項(xiàng)技術(shù)，造福人類(lèi)。

[1] Palermo G,Joris H,Devroey P,et al. Pregnancies after intracytoplasmic injection of single spermatozoon into an oocyte[J]. Lancet，1992，340(8810):17-18

[2] Flaherty SP,Payne D,and Matthews CD. Fertilization failures and abnormal fertilization after intracytoplasmic sperm injection[J]. Hum Reprod，1998，13(1):155-164

[3] Tesarik J,Rienzi L,Ubaldi F,et al. Use of a modified intracytoplasmic sperm injection technique to overcome sperm-borne and oocyte-borne oocyte activation failures[J]. Fertil Steril，2002，78(3):619-624

[4] Yanagida K,Katayose H,Yazawa H,et al. Successful fertilization and pregnancy following ICSI and electrical oocyte activation[J]. Hum Reprod，1999，14(5):1307-1311

[5] Eldar-Geva T,Brooks B,Margalioth EJ,et al. Successful pregnancy and delivery after calcium ionophore oocyte activation in a normozoospermic patient with previous repeated failed fertilization after intracytoplasmic sperm injection[J]. Fertil Steril，2003，79(3):1656-1658

[6] Heindryckx B,Vander Elst J,De Sutter P,et al. Treatment option for spermor oocyte related fertilization failure:assisted oocyte activation following diagnostic heterologous ICSI[J]. Hum Reprod，2005,20(8):2237-2241

[7] 陳蓓麗，曹云霞，章志國(guó)，等. 補(bǔ)救ICSI聯(lián)合人工輔助激活對(duì)IVF失敗卵母細(xì)胞發(fā)育影響的研究[J]. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2011，46(1):33-35

[8] 錢(qián)云,陳娟,聶曉偉,等. Sr2+輔助卵母細(xì)胞激活技術(shù)改善卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)單精子注射受精失敗患者的妊娠結(jié)局[J]. 中華婦產(chǎn)科雜志,2012，47(3):218-219

[9] 張微，宋成，成金泉，等. 卵子受精早期現(xiàn)象的初步探討[J]. 生殖醫(yī)學(xué)雜志，2009，18(3)：197-202

[10] Vanden Meerschaut F,D’Haeseleer E,Gysels H,et al. Neonatal and neurodevelopmental outcome of children aged 3-10 years born following assisted oocyte activation[J]. Reprod Biomed Online,2014，28(1):54-63

[11] Karaca N,Akpak YK,Oral S,et al. A successful healthy childbirth in a case of total globozoospermia with oocyte activation by calcium ionophore[J]. J Reprod Infertil,2015，16(2):116-120

[12] Eindhoven SC,van Uitert EM,Laven JS,et al. The influence of IVF/ICSI treatment on human embryonic growth trajectories[J]. Hum Reprod,2014，29(12):2628-2636