王麗雪，祝筱梅，董寧，任超，盧中秋，姚詠明

膿毒癥(sepsis)是機(jī)體對感染反應(yīng)失調(diào)所致的危及生命的器官功能障礙，包括全身炎癥反應(yīng)、免疫功能紊亂等病理過程[1]。在重癥監(jiān)護(hù)病房中，膿毒癥的發(fā)病率高，治療困難，是患者死亡的主要原因之一[2-3]。越來越多的證據(jù)表明，免疫功能障礙在膿毒癥發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，而樹突細(xì)胞(dendritic cells，DC)凋亡是其關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[4]。在膿毒癥及燒傷模型中脾臟DC顯著減少，且DC凋亡及數(shù)量下降與膿毒癥病情嚴(yán)重程度和不良預(yù)后密切相關(guān)[5]。高遷移率族蛋白B1(high mobility group box-1 protein，HMGB1)是一種重要的膿毒癥晚期細(xì)胞因子，參與膿毒癥狀態(tài)下多器官損害的發(fā)生與發(fā)展[6]。本課題組既往研究證實，HMGB1對DC的免疫功能具有雙向調(diào)節(jié)作用，一定濃度的HMGB1刺激可誘導(dǎo)DC成熟，而高濃度HMGB1則可能導(dǎo)致DC的免疫應(yīng)答反應(yīng)降低[7]，但其確切的調(diào)控機(jī)制尚不明了。

Sestrins(SESNs)是一類在進(jìn)化上高度保守的應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白家族，當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)時其表達(dá)上調(diào)。SESNs廣泛存在于動物體內(nèi)，其中脊椎動物中具有3種SESNs基因，即SESN1、SESN2和SESN3[8]。Sestrin2(SESN2，亦稱Hi95)是SESNs蛋白家族的重要成員，可被多種代謝應(yīng)激條件激活，如缺氧、DNA損傷、氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)等。研究顯示，SESN2表達(dá)活化在減少活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)聚集、維持能量平衡、增強(qiáng)細(xì)胞自噬、降低蛋白質(zhì)合成、減緩代謝性疾病進(jìn)展和調(diào)節(jié)細(xì)胞生長等方面具有重要作用[9]。本研究探討HMGB1刺激對未成熟DC細(xì)胞系DC2.4中SESN2表達(dá)的影響，并通過干預(yù)SESN2基因表達(dá)進(jìn)一步觀察SESN2在HMGB1誘導(dǎo)的DC凋亡效應(yīng)中的作用及意義。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑 小鼠樹突細(xì)胞系DC2.4購自賽百慷(上海)生物技術(shù)股份有限公司。重組人HMGB1(Sigma公司，美國)；兔抗小鼠SESN2單克隆抗體(Abcam公司，美國)；兔抗小鼠胱天蛋白酶(cleaved-caspase-3)多克隆抗體、兔抗小鼠Bcl-2單克隆抗體、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記羊抗兔二抗(Cell Signaling Technology公司，美國)；SESN2 siRNA干擾病毒、SESN2 LV-RNA過表達(dá)病毒(上海漢恒生物科技有限公司)；藻紅蛋白熒光素(PE)-Annexin V/7-AAD凋亡試劑盒(BD公司，美國)。辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)羊抗兔二抗及羊抗鼠二抗、ECL顯影液、BCA蛋白定量試劑盒、預(yù)染蛋白Marker均購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 DC2.4細(xì)胞加入含10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長狀況每2～3d更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)或者進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。實驗一：將復(fù)蘇后的DC2.4培養(yǎng)至3～4代后進(jìn)行分組，包括正常對照組及HMGB1組，HMGB1組給予10ng/ml HMGB1分別刺激8、24、48h(n=4)；實驗二：將細(xì)胞分正常對照組和1、10、100ng/ml HMGB1組(n=4)，分別給予相應(yīng)濃度HMGB1刺激48h；實驗三：將細(xì)胞分為過表達(dá)空載體組(NC)、過表達(dá)空載體HMGB1(100ng/ml)刺激組(NC+HMGB1)、過表達(dá)病毒組(LV-RNA)、過表達(dá)病毒HMGB1(100ng/ml)刺激組(LV-RNA+HMGB1)、沉默空載體組(NS)、沉默空載體HMGB1(100ng/ml)刺激組(NS+HMGB1)、沉默病毒組(siRNA)、沉默病毒HMGB1(100ng/ml)刺激組(siRNA+HMGB1)(n=4)。實驗一、實驗二分組分別用于SESN2表達(dá)及細(xì)胞凋亡的檢測，實驗三用于轉(zhuǎn)染病毒后細(xì)胞凋亡的檢測。

1.2.2 Western blotting檢測蛋白表達(dá) 收集并裂解細(xì)胞，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。SDS-PAGE電泳分離目的蛋白，采用半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，然后置于10%脫脂奶粉中室溫封閉2h，一抗(1∶1000)4℃過夜、二抗室溫孵育1h后，采用ECL顯影試劑盒顯影、成像，凝膠成像儀觀察，Image J軟件分析各組灰度值的強(qiáng)弱。

1.2.3 共聚焦激光顯微鏡(LSCM)觀察SESN2在細(xì)胞中的定位 將不同刺激組細(xì)胞收集于流式管中，PBS清洗2次，4%多聚甲醛室溫下固定30min，PBS清洗2次，0.2% Tritonx-100穿孔約20min；PBS沖洗2次，1% BSA封閉30min，加入一抗(1∶200)4℃孵育過夜，PBS清洗2次，加入熒光二抗(1∶500)37℃孵育1h，PBS清洗1次，將細(xì)胞重懸于約10μl PBS中，滴在蓋玻片上，再滴加約5μl的封片液，在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察蛋白的表達(dá)及其在細(xì)胞中的定位。

1.2.4 慢病毒轉(zhuǎn)染 將DC2.4以2×106/ml密度接種于6孔板，參照漢恒生物科技有限公司的慢病毒使用說明書進(jìn)行操作，轉(zhuǎn)染作用10h后，換用含10%FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3d，熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞綠色熒光(GFP)的表達(dá)。在最佳轉(zhuǎn)染條件下(siRNA的MOI=30，LV-RNA的MOI=45，聚凝胺(polybrene)終濃度為6μg/ml；其流式檢測GFP陽性率均＞90%)，將制備好的以上細(xì)胞按1.2.1中實驗三的方法進(jìn)行分組(n=4)，其中各HMGB1組給予濃度為100ng/ml的HMGB1刺激48h。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測DC2.4細(xì)胞凋亡情況 取各組DC2.4細(xì)胞，PBS洗2次，加100μl緩沖液重懸細(xì)胞，按組別分別加入5μl PE-Annexin V和5μl 7-AAD，室溫避光孵育15min，200μl緩沖液重懸細(xì)胞，1h內(nèi)通過流式細(xì)胞分析儀檢測凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)　果

2.1 HMGB1對SESN2蛋白表達(dá)的影響 與正常對照組比較，10ng/ml HMGB1刺激不同時間(8、24、48h)后，DC2.4細(xì)胞中SESN2蛋白表達(dá)水平逐漸升高，其中24h及48h的SESN2蛋白表達(dá)水平明顯高于正常對照組及8h，且48h的SESN2蛋白表達(dá)水平明顯高于24h，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；刺激8h時的SESN2表達(dá)水平有所下降，但與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，圖1A)。1、10、100ng/ml HMGB1刺激DC2.4細(xì)胞48h后，SESN2蛋白表達(dá)水平均明顯高于正常對照組，且10、100ng/ml HMGB1刺激組SESN2蛋白表達(dá)水平明顯高于1ng/ml HMGB1刺激組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖1B)。

2.2 SESN2在DC2.4細(xì)胞中的定位及表達(dá) 共聚焦激光顯微鏡分析顯示，SESN2蛋白在DC2.4中主要定位于細(xì)胞質(zhì)及核周，100ng/ml HMGB1刺激48h后其表達(dá)較正常對照組明顯增強(qiáng)(圖2A、B)。

圖1 HMGB1對DC2.4細(xì)胞中SESN2蛋白表達(dá)的影響(n=4)Fig. 1 Effect of HMGB1 on the expression of SESN2 in DC2.4 cells (n=4)

2.3 HMGB1對DC2.4細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 采用上述實驗一、二分組的細(xì)胞進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，10ng/ml HMGB1刺激DC2.4不同時間，可誘導(dǎo)DC2.4凋亡逐步增加，以100ng/ml HMGB1作用48h最為顯著；不同濃度(1、10、100ng/ml)HMGB1刺激48h均可誘導(dǎo)DC2.4凋亡增加，其中10、100ng/ml HMGB1作用48h后DC2.4細(xì)胞凋亡率(分別為17.02%±4.85%、17.48%±4.04%)明顯高于正常對照組(7.35%±1.33%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖3A)。Western blotting分析顯示，10、100ng/mlHMGB1刺激48h后，DC2.4細(xì)胞中cleaved-caspase-3活性明顯升高，100ng/ml HMGB1刺激48h后，DC2.4細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)明顯降低，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖3B)。

圖2 SESN2蛋白在DC2.4細(xì)胞中的定位(共聚焦激光顯微鏡 ×400)Fig. 2 The localization of SESN2 in DC2.4 cells (laser scanning confocal microscopy ×400)FITC labeled SESN2 protein, the peak absorption is 488nm (green), DAPI stained nucleus, the peak absorption is 340nm (blue)

2.4 調(diào)控SESN2表達(dá)對HMGB1誘導(dǎo)DC2.4細(xì)胞凋亡的影響

2.4.1 轉(zhuǎn)染LV-RNA和siRNA對SESN2表達(dá)的影響采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染SESN2 LV-RNA可顯著上調(diào)DC2.4細(xì)胞中SESN2蛋白的表達(dá)，與正常對照組及空載體組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01，圖4A)；而轉(zhuǎn)染SESN2 siRNA后DC2.4細(xì)胞中SESN2蛋白表達(dá)與空載體組比較明顯下調(diào)(P＜0.05)，但與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，圖4B)。

2.4.2 干預(yù)SESN2基因表達(dá)對HMGB1誘導(dǎo)的DC2.4細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與空載體組比較，SESN2 LV-RNA轉(zhuǎn)染組HMGB1誘導(dǎo)的DC2.4細(xì)胞凋亡率明顯降低(35.57%±1.69%vs.49.04%±4.87%，P＜0.05，圖5A、C)，且DC2.4細(xì)胞中cleaved-caspase-3活性明顯下降(P＜0.05)，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯增高(P＜0.05，圖5E)。與空載體組比較，轉(zhuǎn)染SESN2 siRNA沉默SESN2基因表達(dá)后，HMGB1誘導(dǎo)的DC2.4細(xì)胞凋亡率明顯增高(65.96%±2.50%vs. 50.01%±2.07%，P＜0.05，圖5B、D)，且DC2.4細(xì)胞中cleaved-caspase-3活性明顯升高、抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖5F)。

圖3 HMGB1對DC2.4細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(n=4)Fig. 3 Effect of HMGB1 on the cell apoptosis of DC2.4 cells and the expression of apoptosis related protein (n=4)

圖4 轉(zhuǎn)染SESN2 LV-RNA和SESN2 siRNA對DC2.4細(xì)胞中SESN2蛋白表達(dá)的影響(Western blotting，n=4)Fig. 4 Effect of LV-RNA or siRNA transfection on the expression of SESN2 in DC2.4 cells (Western blotting, n=4)

3 討　論

膿毒癥是一種復(fù)雜的感染并發(fā)癥，涉及許多交叉級聯(lián)反應(yīng)的激活，包括炎癥、凝血、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等[10]。在膿毒癥的發(fā)展過程中，免疫細(xì)胞(如DC、T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等)的凋亡可導(dǎo)致免疫功能紊亂、多器官功能障礙，甚至引起死亡[11]。DC是體內(nèi)重要的抗原提呈細(xì)胞(APC)，是連接固有免疫與適應(yīng)性免疫的橋梁[12]，其凋亡在膿毒癥免疫功能異常中具有重要意義，與膿毒癥患者預(yù)后密切相關(guān)[5]，而胞外分泌的HMGB1可調(diào)節(jié)DC的成熟、活化及凋亡[13]。本課題組前期研究證實，HMGB1作為一種潛在的免疫調(diào)節(jié)因子，參與調(diào)節(jié)DC和T淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答及凋亡，但其確切調(diào)控機(jī)制仍不明確[7,14]。

研究證實，SESNs可通過抑制哺乳動物西羅莫司靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)蛋白激酶活性、抑制ROS積聚，保護(hù)機(jī)體免受多種應(yīng)激損傷，對細(xì)胞生長及存活具有保護(hù)性作用[15]。SESN2是SESNs蛋白家族的重要成員，作為p53蛋白的底物，與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。在心血管疾病模型小鼠的巨噬細(xì)胞中，上調(diào)SESN2的表達(dá)可有效減輕ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，提示SESN2對于脂質(zhì)相關(guān)性心血管疾病具有保護(hù)作用[16]。另有資料顯示，在LPS誘導(dǎo)的小鼠膿毒癥模型中，SESN2表達(dá)水平較正常對照顯著上調(diào)，而SESN2–/–缺陷小鼠表現(xiàn)為線粒體自噬缺失，最終造成過度炎癥反應(yīng)及死亡率增加[17]。上述研究表明SESN2在炎癥性疾病中具有重要作用。本研究進(jìn)一步探討了SESN2在HMGB1誘導(dǎo)的DC凋亡中的作用及調(diào)節(jié)機(jī)制，旨在為深刻揭示其免疫學(xué)效應(yīng)和干預(yù)途徑奠定理論基礎(chǔ)。

本實驗結(jié)果顯示，較高劑量HMGB1刺激可誘導(dǎo)DC2.4發(fā)生明顯凋亡，其中100ng/ml HMGB1刺激48h最為顯著，與本課題組前期研究結(jié)果一致[18]。SESN2在正常DC2.4中存在表達(dá)，HMGB1刺激后其表達(dá)明顯上調(diào)，尤以10、100ng/ml HMGB1作用48h組最為明顯；激光共聚焦激光顯微鏡觀察顯示，SESN2主要表達(dá)于胞質(zhì)及核周，100ng/ml HMGB1刺激48h后，SESN2表達(dá)明顯增強(qiáng)，可能與DC在HMGB1刺激下發(fā)生成熟異常、功能受損及凋亡有關(guān)。本組資料提示，HMGB1對DC2.4細(xì)胞凋亡的影響以100ng/ml刺激48h最為明顯，因此重點(diǎn)分析了轉(zhuǎn)染SESN2 LV-RNA和siRNA后經(jīng)100ng/ml HMGB1刺激48h DC2.4細(xì)胞凋亡的改變。采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，與空載體組比較，siRNA轉(zhuǎn)染可有效沉默SESN2基因，下調(diào)SESN2蛋白的表達(dá)，加劇HMGB1誘導(dǎo)的DC2.4細(xì)胞凋亡，凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase-3活性明顯增強(qiáng)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯下降；而轉(zhuǎn)染SESN2 LV-RNA可顯著上調(diào)SESN2蛋白的表達(dá)，減輕HMGB1誘導(dǎo)的DC2.4細(xì)胞凋亡，凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase-3活性明顯下降，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯增加。上述結(jié)果提示SESN2對HMGB1誘導(dǎo)的DC2.4細(xì)胞凋亡具有明顯的保護(hù)作用[19]。

圖5 干預(yù)SESN2基因表達(dá)水平對HMGB1誘導(dǎo)的DC2.4細(xì)胞凋亡的影響(n=4)Fig. 5 Effect of regulating the gene expression of SESN2 on DC2.4 apoptosis induced by HMGB1 (n=4)

綜上所述，本研究結(jié)果表明，HMGB1刺激后DC2.4細(xì)胞凋亡率和SESN2蛋白表達(dá)水平均明顯上調(diào)，沉默SESN2基因后HMGB1誘導(dǎo)的DC2.4細(xì)胞凋亡明顯增加，而上調(diào)SESN2基因表達(dá)對HMGB1誘導(dǎo)的DC2.4細(xì)胞凋亡具有保護(hù)效應(yīng)，但其確切信號通路和關(guān)鍵調(diào)節(jié)環(huán)節(jié)仍有待深入探討。進(jìn)一步深入認(rèn)識膿毒癥狀態(tài)下SESN2對免疫細(xì)胞凋亡的影響與作用，將為膿毒癥的免疫調(diào)理提供新的思路。

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