周 堅(jiān)，張華鋒，王亞瓊，陳 榮，魯 輝

(蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究中心，蘇州 215104)

阿膠珠為馬科動(dòng)物驢EquusasinusL.的干燥皮或鮮皮經(jīng)煎煮、濃縮制成的固體膠(阿膠)的炮制品[1]。在古代有豬脂浸炙、炒制、熬制、蛤粉炒制和蒸制等法，現(xiàn)代炮制有生制、蛤粉炒制和蒲黃炒制等法。古代阿膠所采用的各類炮制方法，具有矯臭矯味、使其質(zhì)地酥脆而便于粉碎和降低其膩滯性的作用[2-8]。蒲黃生用性涼，行血而兼消，炒后味澀，調(diào)血補(bǔ)血且止血，蒲黃炒阿膠會(huì)增強(qiáng)其補(bǔ)血止血作用[9-14]。江浙地區(qū)盛產(chǎn)蒲黃，蒲黃炒阿膠自古盛行，但缺乏相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)蒲黃炒阿膠的質(zhì)量進(jìn)行控制，阿膠經(jīng)蒲黃炒制后產(chǎn)生哪些變化也沒(méi)有相關(guān)資料參考，本實(shí)驗(yàn)以《中國(guó)藥典》2015年版阿膠[15]項(xiàng)下的檢驗(yàn)項(xiàng)目為參考，考察阿膠經(jīng)蒲黃炒制后的變化。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀，配VWD檢測(cè)器，ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)(安捷倫科技有限公司)；UPLC-Xevo TQ-S質(zhì)譜儀，配Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)(沃特世科技有限公司)；Xseries 2 ICP-MS，Sorvall ST 8 臺(tái)式離心機(jī)(賽默飛世爾科技公司)；AG245電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；BX43顯微鏡(奧林巴斯有限公司)。

1.2試藥 異硫氰酸苯酯(PITC)、三乙胺、甲酸和乙腈(Sigma-Aldrich公司)；碳酸氫銨、醋酸鈉、醋酸、鹽酸、水合氯醛和氫氧化鈉均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胰蛋白酶(批號(hào)140615-200206，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；超純水(Millpore公司)。

所用對(duì)照品均來(lái)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，L-羥脯氨酸(批號(hào)111578-201602)，甘氨酸(批號(hào)140689-201605)，丙氨酸(批號(hào)140680-201604)，L-脯氨酸(批號(hào)140677-201507)，阿膠(批號(hào)121274-201202)。蒲黃炒阿膠的樣品自行炮制3批，樣品信息見(jiàn)表1。

表1樣品信息

Tab.1 Sample information

蒲黃炒阿膠編號(hào)阿膠編號(hào)廠家批號(hào)QS0248SZ2016QS0248山東陽(yáng)谷古阿井阿膠廠2015122401QS0801SZ2016QS0801河南省四方藥業(yè)集團(tuán)有限公司160309QS0825SZ2016QS0825山東濟(jì)水阿膠有限公司20160123

2 結(jié)果

2.1炮制與性狀 自行炮制3批，炮制過(guò)程中，蒲黃易生火、起煙，溫度較難控制。建議先將阿膠塊放入40 ℃烘箱中加熱軟化，切制成小方塊狀，再熱鍋把蒲黃迅速炒制至黃褐色后，將阿膠塊放入翻炒，鼓起后迅速撈出，關(guān)火降溫。阿膠珠樣品呈圓球狀，表面呈深土黃色，質(zhì)脆泡酥，中空，略呈海綿狀，不黏連，無(wú)枯焦。

2.2顯微鑒別 粉末呈褐色。可見(jiàn)蒲黃花粉粒，花粉粒類圓形或橢圓形，直徑18～25 μm，表面有網(wǎng)狀雕紋，周邊輪廓線光滑，呈凸波狀或齒輪狀，具單孔，不甚明顯。阿膠部分為大量圓形油滴，可見(jiàn)孔洞樣透明塊狀物。

2.3質(zhì)譜鑒別 隨著科技的發(fā)展和質(zhì)譜的普及，越來(lái)越多的中藥材開(kāi)始采用質(zhì)譜法進(jìn)行質(zhì)量控制和研究[16-19]。本項(xiàng)目按照《中國(guó)藥典》2015年版阿膠項(xiàng)下測(cè)定，取蒲黃炒阿膠粉末0.1 g，加入質(zhì)量濃度為10 g·L-1的碳酸氫銨溶液50 mL，超聲處理30 min，用微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液100 μL，置于微量進(jìn)樣瓶中，加胰蛋白酶溶液10 μL(取序列分析用胰蛋白酶，加入質(zhì)量濃度為10 g·L-1的碳酸氫銨溶液配制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的胰蛋白酶溶液，臨用時(shí)配制)，搖勻，37 ℃恒溫酶解12 h，作為供試品溶液。另取阿膠對(duì)照藥材0.1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。采用質(zhì)譜檢測(cè)器，電噴霧正離子模式(ESI+)，進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，選擇質(zhì)荷比(m/z)539.8 (雙電荷)→ 612.4和m/z539.8(雙電荷)→ 923.8作為檢測(cè)離子對(duì)。吸取供試品溶液5 μL，注入高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，測(cè)定。3批樣品均呈現(xiàn)與對(duì)照藥材色譜保留時(shí)間一致的色譜峰，見(jiàn)圖1。

2.4水分 按照《中國(guó)藥典》2015年版阿膠項(xiàng)下規(guī)定水分不得過(guò)15.0%，本實(shí)驗(yàn)3批樣品測(cè)定結(jié)果分別為5.2%，5.5%和5.7%，蒲黃炒制導(dǎo)致水分含量降低，建議以均值120%為限，規(guī)定水分不得過(guò)6.5%。

2.5重金屬及有害元素 《中國(guó)藥典》2015年版阿膠項(xiàng)下規(guī)定，鉛、鎘、砷、汞和銅分別不得超過(guò)5，0.3，2，0.2和20 mg·kg-1。3批樣品中重金屬及有害元素測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2，建議蒲黃炒阿膠的重金屬及有害元素限量同《中國(guó)藥典》2015年版阿膠項(xiàng)下規(guī)定。

表2蒲黃炒阿膠中鉛、鎘、砷、汞及銅的含量

Tab.2 The contents of Cu，As，Cd，Hg and Pb in donkey-hide gelatine fied by cattail pollen (mg·kg-1)

圖1樣品MRM圖譜

A.m/z539.8→ 612.4離子對(duì)；B.m/z539.8→ 923.8離子對(duì)；1.離子對(duì)峰。

Fig.1 MRM chromatography of the sample

A.m/z539.8→ 612.4 ion pair；B.m/z539.8→ 923.8 ion pair；1.ion peak.

2.6水不溶物 《中國(guó)藥典》2015年版阿膠項(xiàng)下規(guī)定水不溶物含量不得過(guò)2.0%。本實(shí)驗(yàn)3批樣品測(cè)定結(jié)果分別為4.7%，2.2%及1.1%。鑒于蒲黃的附著，可能導(dǎo)致水不溶物增加，因此建議刪除此項(xiàng)。

2.7氨基酸含量測(cè)定

2.7.1標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性考察 將混合對(duì)照品溶液稀釋為5個(gè)質(zhì)量濃度，分別進(jìn)樣10 μL，以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程，得L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸及L-脯氨酸的回歸方程分別為y=7 895x+25.36(r=0.999 9)，y=9 632x+15.74(r=0.999 9)，y=6 875x+58.34(r=0.999 9)和y=7 324x+42.35(r=0.999 9)，線性范圍分別為0.034～0.510，0.015～0.225，0.028～0.421和0.023～0.345 mg·mL-1。結(jié)果表明，線性關(guān)系良好。

2.7.2精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6 次，按照峰面積計(jì)算L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸及L-脯氨酸的RSD值分別為0.18%，0.08%，0.15%和0.1%。結(jié)果表明，該方法精密度良好。

2.7.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別于2，4，8，12，16和24 h 注入液相色譜儀，結(jié)果顯示，供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定，6 次測(cè)定L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸及L-脯氨酸的RSD值分別為0.35%，0.21%，0.23%和0.24%。結(jié)果表明，樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7.4重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批(批號(hào)QS0248)樣品，制備6份樣品溶液進(jìn)樣測(cè)定，得L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸及L-脯氨酸的RSD值分別為2.78%，1.48%，1.39%和1.54%。結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.7.5加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一批(批號(hào)QS0248)樣品5份，每份分別精密加入等質(zhì)量的混合對(duì)照品溶液，同《中國(guó)藥典》2015年版阿膠[15]項(xiàng)下樣品制備方法制備后進(jìn)樣，以外標(biāo)法計(jì)算平均回收率和RSD值。結(jié)果見(jiàn)表3。

表34種氨基酸含量測(cè)定的回收率結(jié)果

Tab.3 The results of recovery test of the quantitative analysis of 4 amino acids

成分平均含量/%加入量/%平均測(cè)得量/%平均回收率/%L-羥脯氨酸8.410.0018.095.9甘氨酸18.020.0037.798.5丙氨酸7.110.0016.796.3L-脯氨酸10.210.0020.097.6

2.7.6含量測(cè)定 按照《中國(guó)藥典》2015年版阿膠項(xiàng)下干燥品的規(guī)定計(jì)算，含L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和L-脯氨酸分別不得少于8.0%，18.0%，7.0%和10.2%，3批樣品測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。阿膠經(jīng)蒲黃炒制后樣品色譜圖與原阿膠樣品色譜圖無(wú)異且含量差別變化不大，見(jiàn)圖2。因此，建議同《中國(guó)藥典》2015年版阿膠項(xiàng)下規(guī)定。

圖2HPLC圖

A.混合對(duì)照品溶液；b.阿膠樣品溶液；c.蒲黃炒阿膠樣品溶液；1.L-羥脯氨酸；2.甘氨酸；3.丙氨酸；4.L-脯氨酸。

Fig.2 HPLC chromatograms

A.mixed reference solution；b.sample of donkey-hide gelatine；c.sample of donkey-hide gelatine fied by cattail pollen；1.L-hydroxyproline；2.glycine；3.alanine；4.L-proline.

表4蒲黃炒阿膠后4種氨基酸的含量變化

Tab.4 The changes of the contents of 4 amino acids in donkey-hide gelatine fied by cattail pollen

編號(hào)L-羥脯氨酸/%炒制后炒制前甘氨酸/%炒制后炒制前丙氨酸/%炒制后炒制前L-脯氨酸/%炒制后炒制前QS02488.48.818.018.77.07.610.210.8QS080110.29.921.221.78.18.912.012.4QS08258.89.219.220.77.58.010.911.5

3 討論

近年來(lái)，由于冬季膏方的盛行，越來(lái)越多的阿膠被直接投入于膏方中熬制，很少再用炮制品，但自古阿膠的炮制具有增效降膩的作用，炮制作為一門古老的技藝也逐漸被快節(jié)奏、簡(jiǎn)易的用藥方法取代，但中藥的服用終歸還需依照中醫(yī)用藥的老傳統(tǒng)，才能夠更好地發(fā)揮藥效，為病體康健提供保障。

為了杜絕近年來(lái)在阿膠中添加豬皮、牛皮等弄虛作假行為，阿膠的法定藥典標(biāo)準(zhǔn)已越來(lái)越全面，然而各種炮制品卻沒(méi)有得到同等的重視，蒲黃炒阿膠作為江浙地區(qū)盛行的炮制方法，阿膠珠也作為地方特色在市井的藥房中存在，對(duì)蒲黃炒阿膠的質(zhì)量進(jìn)行控制，填補(bǔ)阿膠炮制品質(zhì)量控制的空白，對(duì)地方特色品種進(jìn)行保護(hù)和傳承。

阿膠經(jīng)蒲黃炒制后，性狀發(fā)生了很大變化，由堅(jiān)韌黏膩?zhàn)兊盟执嘁姿?，便于藥用。顯微鑒別中增加了蒲黃花粉粒的特征，雖然炒制后，僅阿膠珠表層黏附一層薄薄的蒲黃花粉粒，但對(duì)于用藥而言，增加了一味能夠止血、化瘀、通淋的中藥。由于蒲黃花粉粒的附著，導(dǎo)致阿膠珠的水不溶物含量增加，實(shí)驗(yàn)中將蒲黃花粉粒洗去后，再次測(cè)定，基本無(wú)水不溶物，可見(jiàn)炒制更有利于增加阿膠的水溶性。同時(shí)，高溫炒制并不影響質(zhì)譜中特征離子和4種氨基酸成分的分析，且蒲黃炒制后樣品色譜圖與原阿膠樣品色譜圖基本一致，4種氨基酸的含量并無(wú)顯著差別，由此可見(jiàn)，控制阿膠及阿膠珠的質(zhì)量，僅通過(guò)氨基酸的分析還不夠，應(yīng)尋找具有藥效價(jià)值的蛋白、多肽或其他類成分等進(jìn)行質(zhì)量控制。隨著科技的進(jìn)一步發(fā)展，還需要更多的成分分析參與來(lái)尋找炮制后的特征產(chǎn)物。本實(shí)驗(yàn)為蒲黃炒阿膠質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了有力參考，同時(shí)也為進(jìn)一步研究指明了方向。

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